Taq polimerasa

Taq polimerasa I DNA polimerasa egonkorra da, Thermus aquaticus mikroorganismo termofiliko eubakterioaren ondorioz izendatua, izan ere, izaki hartatik isolatu zuten 1976an Chien et al.-ek.[1] Bere izena sarritan laburtu ohi da Taq edota Taq pol deituz. Polimerasa hau maiz erabili ohi da polimerasaren kate-erreakzioan (PCR), DNAren segmentu laburren kopurua nabarmenki anplifikatzeko metodo bat.

Taq polA-ren (Klenow) fragmentu luzea, zeinak polA eta bestigial domeinuak dituen
I DNA polimerasa, termoegonkorra
Identifikatzaileak
Organismoa Thermus aquaticus
Simboloa polA
Uniprot P19821
Bilatu
Estrukturak Swiss-model
Domeinuak InterPro

T. aquaticus ur termaletan eta iturri hidrotermaletan bizi den bakterioa da eta haren polimerasa, Taq polimerasa[1], PCR prozesuan behar ziren desnaturalizazio-baldintzak (tenperatura handiak) jasateko gai den entzima gisa identifikatu zen.[2] Termoegonkortasun horri esker, Taq polimerasa erabiltzen hasi zen, jatorriz PCRan erabiltzen zen E. coli-ren DNA polimerasaren ordez.[3]

Propietate entzimatikoak

Taq polimerasa-ren aktibitaterako tenperatura optimoa 75-80ºC artean dago, tenperatura horretan polimerizazio-tasa optimoa lortzen du eta tenperatura-tarte optimoaren edozein desbideraziok entzimaren luzapen-tasa inhibitzen du. 90ºC baino altuagoko tenperaturetan, Taq oso aktibitate baxua dauka edo ez du inolako aktibitaterik, entzimak desnaturalizatzen  ez den eta osorik mantentzen den arren.[4] Erreakzio-hodian zenbait ioiren presentzia egoteak ere entzimaren jarduera espezifikoari eragiten dio, adibidez, potasio kloruro (KCl) eta magnesio ioien (Mg2+)  kantitate txikiek aktibitate entzimatikoa sustatzen dute eta hauen kontzentrazio altuek, aldiz, aktibitatea inhibitzen dute.[5]

PCRan

1980ko hamarkadaren hasieran, Kary Mullis Cetus Corporation enpresan DNA sintetikoen aplikazio bioteknologikoak ikertzen zebilen. Maiz erabili ohi zituen DNA oligonukleotidoak itu DNA sekuentziekin lotzeko probetan, baita oligonukleotido hauek hasle gisa bezala erabili DNA sekuentziazio eta cDNA (DNA osagarria) sintesirako. 1983. urtean, bi hasle erabiliz hasi zen, bakoitzak itu DNAko harizpietako batekin hibridatzeko  eta erreakziora DNA polimerasa gehitu zuen. Honen ondorioz, DNA erreplikazio esponentziala[6] burutu izan zen, hasleen arteko DNA segmentua nabarmenki anplifikatzea lortuz.[3]

Hala ere, erreplikazio ziklo bakoitzaren ostean, nahastea 90ºC baino gehiagoko tenperaturara berotu behar da, DNA sortu berria desnaturalizatzeko, harizpiak banatzea ahalbidetuz, harizpiek hurrengo zikloetako molde gisa joka dezaten. Berotze urrats honek jatorriz erabilitako DNA polimerasa, Klenow fragmentua (E. coli-tik isolatua) inaktibatzen zuen, ez ordea Taq polimerasa. Honi esker, Taq polimerasa oso erabilgarria da PCRa burutzeko, DNA harizpiak banatzeko ezarri beharreko 95ºC tenperatura jasan baitezake oraindik aktibitate katalitikoa mantenduz, hau da, desnaturalizatu gabe.

Taq termoegonkorraren erabilerak ahalbidetzen du PCR erreakzioa tenperatura altuetan burutzea (~60 °C eta altuagoak), hasleen espezifikotasuna altuagoa eta produktu inespezifikoen (hasleen dimeroak, esaterako) kopurua urriagoa izango direlarik. Horrez gain, polimerasa termoegonkorra erabiltzeari esker uneoro entzima berak burutuko du anplifikazioa, ziklo guztietan, termozikladoreko ziklo berri bakoitzaren aurretik entzima berria gehitu behar izatea saihestuz. Tutu itxia makina erlatiboki sinple batean sartuta prozesu guztia burutu daiteke eta beraz, Taq polimerasaren erabilera gakoa izan zen PCR teknika DNA analisiarekin erlazionatuta zeuden biologia molekularreko zenbait arlo ezberdinetan aplikatu ahal izateko.[2]

Patente arazoak

Hoffmann-La Roche enpresak PCR eta Taq patenteak erosi zizkion Cetus enpresari 330 milioi dolarren truke, geroago haiei esker 2000 milioi dolar baino gehiago irabaziz.[7]1989. urtean, Science aldizkariak Taq polimerasa lehendabiziko “Urteko Molekula” gisa izendatu zuen. Kary Mullis-ek Kimikako Nobel Saria jaso zuen 1993an, konpainia bioteknologiko batean ikerketa egitearen ondorioz saritutako pertsona bakarra izanik. 1990eko hamarkadaren hasieran, Taq polimerasa erabiliz PCR teknika hainbat arlotan erabiltzen ari zen, hala nola, oinarrizko biologia molekularreko ikerketan, testaketa klinikoan eta arlo forensean. Horrez gain, HIES kasuetako GIB birusa era zuzenean detektatzeko erabiltzen hasi zen.[8]

1999ko abenduan, Vaughn Walker AEBko distritu epaileak erabaki zuen Taq polimerasaren inguruko 1990eko patentea kaltetuta zegoela, neurri batean Cetus Corporation-eko zientzialariek egindako baieztapen eta informazio okerrak zirela eta. Epaileak Promega Corporation-ek Hoffman-La Roche-ren aurka egindako lehiaketa babestu zuen, Hoffman-La Roche-k Taq patentea 1991ean bereganatu zuelarik. Walker epaileak aurretik beste laborategi batzuetan burututako aurkikuntzak iruzkindu zituen, haien artean, Cincinnati-ko unibertsitateko John Trela-k burututakoa, epaileak hartutako erabakiaren oinarri gisa.[9]

Taq DNA polimerasa osoa DNA oktameroari lotuta
Taq polimerasa, exonukleasa
Identifikatzaileak
Sinboloa Taq-exonuc
Pfam PF0981
InterPro IPR015361
SCOP2 1qtm / SCOPe / SUPFAM
Eskuragarri dauden proteinaren estrukturak:
Pfam structures / ECOD
PDB RCSB PDB / PDBe / PDBj
PDBsum structure summary

Domeinuen egitura

Exonukleasa domeinua

Taq PolA entzimak E. coli-ren PolA entzimaren egitura orokor antzekoa du. Erdiko 3’-5’ exonukleasa domeinua proba-irakurketa aktibitateaz arduratzen dena, hau nabarmenki aldatua dagoenez, ez da funtzionala.[10] Hala ere, entzimak badauka 5’-3’ exonukleasa domeinua amino muturrean, zeinak, E. coli-ren domeinua ez bezala, ez duen hasleen degradazioa burutzen.[11] Gainera, zundekin ere oso erabilgarria da, izan ere, harizpi berriak sintetizatu ahala Taq polimerasak 5’ -3’ zundetako fluoroforoak ebaki eta aske uzten ditu.[12]

Mutanteak

Zuzenduriko mutagenesi bidezko esperimentu baten bidez 3’-5’ exonukleasa aktibitatea hobetzea lortu izan da, baina ez da ezaguna horrek entzimaren errore-tasa murrizten duen ala ez.[13] Mutante hauen adibide kimera proteinak izan daitezke, zeinetan proba-irakurketadun entzima sortzea lortu izan den, baina, zoritxarrez, tenperatura optimo eta termoegonkortasun baxuagoa duen.[14] Bestalde, 5’-3’ exonukleasa domeinurik gabeko polimerasaren aldaerak sortu izan dira (Klentaq eta Stoffel fragmentuak), hauek bigarren mailako egiturak dituzten hasleekin erabiltzeko egokiak dira, baita molekula zirkularren erreplikaziorako ere.[15]

Garrantzia gaixotasunen detekzioan

Taq polimerasak PCR-ko DNA erreplikazioan zenbait hobekuntza eragin zituen, hala nola, espezifizitate altuagoa, produktu inespezifiko gutxiago eta ekipamendu zein prozesu errazagoak.[16] Entzimak rol gakoa izan du munduko gaixotasun txarrenen detekzioan, bizitza ugari salbatzen lagunduz, haien artean, tuberkulosia, pneumonia atipikoa, HIESa, paperak eta hepatitisa, besteak beste.[17]

PCR probak Taq polimerasarekiko duen beharra bereziki nabarmendu izan da 2020. urteko COVID-19 pandemian zehar, hainbat herrialdetan entzimaren eskasia egon baita eta ondorioz, Taq polimerasarik gabe gaixotasunaren detekziorako prozesua askoz motelagoa eta zailagoa baita.[18]

Taq polimerasaren erabilerak baditu bere mugak ere, izan ere, gaixotasun batzuetan, erretrobirusek mutazioak izaten dituzte haien genoman, eta Taq polimerasaren fideltasun erlatiboki baxuaren ondorioz mutazio berdinak gerta daitezke erreplikazioan zehar. Arrazoi hau dela medio, nahiko posiblea da testaren emaitza positibo faltsua izatea.[19]

Erreferentziak
  1. Chien, A.; Edgar, D. B.; Trela, J. M.. (1976-09). «Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus» Journal of Bacteriology 127 (3): 1550–1557.  doi:10.1128/jb.127.3.1550-1557.1976. ISSN 0021-9193. PMID 8432. PMC PMC232952. (Noiz kontsultatua: 2022-03-30).
  2. Saiki, R. K.; Gelfand, D. H.; Stoffel, S.; Scharf, S. J.; Higuchi, R.; Horn, G. T.; Mullis, K. B.; Erlich, H. A.. (1988-01-29). «Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase» Science (New York, N.Y.) 239 (4839): 487–491.  doi:10.1126/science.2448875. ISSN 0036-8075. PMID 2448875. (Noiz kontsultatua: 2022-03-30).
  3. Saiki, R. K.; Scharf, S.; Faloona, F.; Mullis, K. B.; Horn, G. T.; Erlich, H. A.; Arnheim, N.. (1985-12-20). «Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia» Science (New York, N.Y.) 230 (4732): 1350–1354.  doi:10.1126/science.2999980. ISSN 0036-8075. PMID 2999980. (Noiz kontsultatua: 2022-03-30).
  4. PCR protocols : a guide to methods and applications. Academic Press 1990 ISBN 0-12-372180-6. PMC 19723112. (Noiz kontsultatua: 2022-03-30).
  5. PCR technology : principles and applications for DNA amplification. Stockton Press 1989 ISBN 0-935859-56-X. PMC 19323242. (Noiz kontsultatua: 2022-03-30).
  6. Mullis, K. B.. (1990-04). «The unusual origin of the polymerase chain reaction» Scientific American 262 (4): 56–61, 64–65.  doi:10.1038/scientificamerican0490-56. ISSN 0036-8733. PMID 2315679. (Noiz kontsultatua: 2022-03-30).
  7. Fore, Joe; Wiechers, Ilse R.; Cook-Deegan, Robert. (2006-07-03). «The effects of business practices, licensing, and intellectual property on development and dissemination of the polymerase chain reaction: case study» Journal of Biomedical Discovery and Collaboration 1: 7.  doi:10.1186/1747-5333-1-7. ISSN 1747-5333. PMID 16817955. PMC 1523369. (Noiz kontsultatua: 2022-03-30).
  8. Guatelli, J. C.; Gingeras, T. R.; Richman, D. D.. (1989-04). «Nucleic acid amplification in vitro: detection of sequences with low copy numbers and application to diagnosis of human immunodeficiency virus type 1 infection» Clinical Microbiology Reviews 2 (2): 217–226.  doi:10.1128/CMR.2.2.217. ISSN 0893-8512. PMID 2650862. PMC PMC358112. (Noiz kontsultatua: 2022-03-30).
  9. https://web.archive.org/web/20160303232746/http://news.bio-medicine.org/biology-news-2/Historical-information-available-on-Taq-polymerase-findings-at-the-University-of-Cincinnati-12158-1/
  10. Eom, S. H.; Wang, J.; Steitz, T. A.. (1996-07-18). «Structure of Taq polymerase with DNA at the polymerase active site» Nature 382 (6588): 278–281.  doi:10.1038/382278a0. ISSN 0028-0836. PMID 8717047. (Noiz kontsultatua: 2022-03-30).
  11. «Will the 5'→3' flap endonuclease activity of Taq DNA Polymerase degrade primers? | NEB» www.neb.com (Noiz kontsultatua: 2022-03-30).
  12. «TaqMan» www.ncbi.nlm.nih.gov (Noiz kontsultatua: 2022-03-30).
  13. Park, Y.; Choi, H.; Lee, D. S.; Kim, Y.. (1997-06-30). «Improvement of the 3'-5' exonuclease activity of Taq DNA polymerase by protein engineering in the active site» Molecules and Cells 7 (3): 419–424. ISSN 1016-8478. PMID 9264032. (Noiz kontsultatua: 2022-03-30).
  14. Villbrandt, B.; Sobek, H.; Frey, B.; Schomburg, D.. (2000-09). «Domain exchange: chimeras of Thermus aquaticus DNA polymerase, Escherichia coli DNA polymerase I and Thermotoga neapolitana DNA polymerase» Protein Engineering 13 (9): 645–654.  doi:10.1093/protein/13.9.645. ISSN 0269-2139. PMID 11054459. (Noiz kontsultatua: 2022-03-30).
  15. Pelt-Verkuil, Elizabeth van. (2008). Principles and technical aspects of PCR amplification. Springer ISBN 978-1-4020-6241-4. PMC 261325797. (Noiz kontsultatua: 2022-03-30).
  16. Menon, P. K.; Kapila, K.; Ohri, V. C.. (1999-07). «POLYMERASE CHAIN REACTION AND ADVANCES IN INFECTIOUS DISEASE DIAGNOSIS» Medical Journal, Armed Forces India 55 (3): 229–231.  doi:10.1016/S0377-1237(17)30450-1. ISSN 0377-1237. PMID 28775636. PMC 5531883. (Noiz kontsultatua: 2022-03-30).
  17. (Ingelesez) «Polymerase chain reaction (PCR)» stanfordhealthcare.org (Noiz kontsultatua: 2022-03-30).
  18. (Ingelesez) «FDA chief warns of supply 'pressure' on reagents for coronavirus tests» MedTech Dive (Noiz kontsultatua: 2022-03-30).
  19. Overbaugh, J.; Jackson, S. M.; Papenhausen, M. D.; Rudensey, L. M.. (1996-11-20). «Lentiviral genomes with G-to-A hypermutation may result from Taq polymerase errors during polymerase chain reaction» AIDS research and human retroviruses 12 (17): 1605–1613.  doi:10.1089/aid.1996.12.1605. ISSN 0889-2229. PMID 8947295. (Noiz kontsultatua: 2022-03-30).

Kanpo estekak
This article is issued from Wikipedia. The text is licensed under Creative Commons - Attribution - Sharealike. Additional terms may apply for the media files.