Fluoreska mikroskopo estas optika mikroskopo kiu uzas fluoreskon anstataŭ aŭ krom, disĵeto, reflekto, kaj atenuado aŭ sorbo, por studi la ecojn de organikaj aŭ neorganikaj substancoj.[1][2] "Fluoreska mikroskopo" temas pri ajna mikroskopo kiu uzas fluoreskon por produkti bildon, ĉu ĝi estas simpla kiel epifluoreska mikroskopo aŭ pli komplika kiel konfokala mikroskopo, kiu uzas optikan sekciigon por atingi pli bonan solvapovon de la fluoreska bildo.[3]
Principo
La specimeno estas lumigita kun lumo de specifa ondolongo (aŭ ondolongoj) kiu estas sorbita de la fluoroforoj, kaŭzanta ilin elsendi lumon de pli longaj ondolongoj (t.e., de malsama koloro ol la sorbitan lumon). La lumiganta lumo estas apartigita de la multe pli malforta elsenditan fluoreskon pere de spektra elsenda filtrilo. Tipaj eroj de fluoreska mikroskopo estas luma fonto (ksenono arka lampo aŭ hidrargo-vapora lampo estas ofta; pli altnivelaj specoj estas alta-potenco LEDs kaj laseroj), la ekscita filtrilo, la dikroa spegulo (aŭ dikroa faskodividilo) kaj la elsenda filtrilo (vidu skemon sube). La filtriloj kaj la dikroa faskodividilo estas elektita por kongrui kun la spektran ekscitan kaj elsendan ecojn de la fluoroforo uzita por etikedi la specimenon.[1] Tiamaniere, la distribuo de ununura fluoroforo (koloro) bildigas samtempe. Mikskoloraj bildoj de pluraj specoj de fluoroforoj devas esti kunmetitaj per kombino de plurajn ununuran-koloraj bildoj.
La plimulto de uzataj fluoreskaj mikroskopoj estas epifluoreska mikroskopoj, kie ekscito de la fluoroforo kaj detekto de la fluoresko estas farita tra la sama luma vojo (t.e. tra la objektivo). Ĉi tiuj mikroskopoj estas ĝenerale uzita en biologio kaj estas la bazo por pli altnivelaj mikroskopaj desegnoj, kiel la konfokala mikroskopo kaj la tuta interna reflekto fluoreska mikroskopo (TIRF).
Epifluoreska mikroskopio
La plimulto de fluoreskaj mikroskopoj, precipe tiuj uzitaj en la vivaj sciencoj, estas de la epifluoreska desegno montrita en la skemon. Lumo de la ekscita ondolongo lumigas la specimenon tra la objektiva lenso. La fluoresko elsendita de la specimeno estas koncentrita al la detektilo fare de la sama objektivo kiu estas uzita por la ekscito. Plibonan solvapovo postulas objektivan lenson kun pli alta numera aperturo. Pro tio ke plejparto de la ekscitanta lumo trapasas la specimeno, nur reflektita ekscitanta lumo atingas la objektivon kune kun la elsenditan lumon; sekve la epifluoreska metodo havas altan signalo-al-bruo proporcion. La dikroa faskodividilo agas kiel ondolongo specifa filtrilo, lasante fluoreska lumo trapasi al la okulario aŭ detektilo, sed reflektante ajnan restantan ekscitantan lumon reen al la fonto.
Lumaj fontoj
Fluoreska mikroskopio postulas intensan kvazaŭ-unukromata lumigo, kiu kelkaj komunaj lumaj fontoj, kiel halogenaj lampoj ne povas provizi. Kvar ĉefaj tipoj de luma fonto estas uzita, inkluzivanta ksenonaj arkaj lampoj aŭ hidrargo-vaporaj lampoj kun ekscita filtrilo, laseroj, "supercontinuum" fontoj kaj alta-potenco LEDs. Laseroj estas plej ĝenerale uzita por pli kompleksa fluoreska mikroskopio teknikoj kiel konfokala mikroskopio kaj tuta interna reflekto fluoreska mikroskopo dum ksenonaj lampoj kaj hidrargaj lampoj, kaj LEDs kun dikroa ekscita filtrilo estas ofte uzita por larĝ-vidkampaj epifluoreskaj mikroskopoj. Pere de du aroj da mikrolensoj enmetitaj en la lumiga vojo de larĝ-vidkampa epifluoreska mikroskopo, tre unuforma lumigo kun koeficiento de vario de 1-2% povas esti atingita.[4]
Fluoreska mikrobildo galerio
Z-projekcio de ostosarkoma ĉelo, kolorita per faloidino por bildigi aktinajn filamentojn. La bildo estis prenita sur konfokala mikroskopo, kaj la posta dekonvolucio estis farita uzante eksperimente derivitan punkt-sternan funkcion.
Epifluoreska bildigo de la tri komponentoj en dividanta homa kancera ĉelo. DNA estas kolorita blue, proteino nomata INCENP estas verda, kaj la mikrotubuloj ruĝaj. Ĉiu fluoroforo estas bildigita aparte uzante malsaman kombinaĵon de ekscitaj kaj elsendaj filtriloj, kaj la bildoj estas kaptitaj sinsekve uzante ciferecan CCD-kameraon, kaj poste superkovrititaj por obteni kompletan bildon.
Endoteliaj ĉeloj sub la mikroskopo. Kernoj estas koloritaj bluaj per DAPI, mikrotubuloj estas markitaj verdaj per antikorpo ligita al FITC kaj aktinaj filamentoj estas markitaj ruĝe kun faloidino ligita al TRITC. Bovaj pulmaj arteriaj endoteliaj (BPAE) ĉeloj.
3D dukolora super-solvopova mikroskopio kun Her2 kaj Her3 en mamaj ĉeloj, kolorigitaj per Alexa 488 kaj Alexa 568. LIMON microscopy
Homa limfocia kerno kolorigita per DAPI kun centromeraj sondoj hibridigitaj (fluoreska in situ hibridigo (FISH)) por kromosomoj 13 (verda) kaj 21 (ruĝa).
Gistaj ĉelaj membranoj bildigitaj de iuj membranaj proteinoj kunfanditaj kun fluoreskaj markiloj RFP kaj GFP. Superkovrito de lumo de ambaŭ markiloj rezultas en flava koloro.
Super-solvopova mikroskopio: detekto de unuopa YFP-molekuloj en homa kancera ĉelo. Tipaj distancmezuradoj ĉirkaŭ 15 nm, mezuritaj kun Vertico-SMI / SPDMphymod-mikroskopo.
Super-solvopova mikroskopio: kunlokaliza mikroskopo (2CLM) kun GFP kaj RFP-fandataj proteinoj (kerno de ostkancera ĉelo) 120.000 lokalizitaj molekuloj en larĝa vidkampo (470 µm2) mezuritaj kun vertikala-SMI / SPDMphymod-mikroskopo
Fluoreska mikroskopio de DNA transskribo en homa sovaĝa tipo kaj P239S-Mutant-Palladin.
Fluoreskaj mikroskopaj bildoj de sunbrula patologio en sangoĉelo montrante la trafitajn areojn en ruĝo.
Vidu ankaŭ
Referencoj
- 1 2 Introduction to Fluorescence Microscopy. Nikon MicroscopyU. Alirita 2008-09-28.
- ↑ The Fluorescence Microscope. Microscopes—Help Scientists Explore Hidden Worlds. The Nobel Foundation. Alirita 2008-09-28.
- ↑ Juan Carlos Stockert, Alfonso Blázquez-Castro. (2017) Fluorescence Microscopy in Life Sciences. Bentham Science Publishers. ISBN 978-1-68108-519-7. Arkivita kopio. Arkivita el la originalo je 2019-05-14. Alirita 2020-06-26.
- ↑ F.A.W. Coumans (2012). “Flat-top illumination profile in an epi-fluorescence microscope by dual micro lens arrays”, Cytometry Part A 81 (4), p. 324–331. doi:10.1002/cyto.a.22029.