Chromatographie

Zusammenhänge in der Chromatographie und Vergleiche

In der Chromatographie werden unterschiedliche Substanzen (= Treibgut) in der so genannten mobilen Phase (= Wasser) auf einer stationären Phase (= Flussbett) befördert. Aufgrund der Wechselwirkungen (siehe die Einteilung unter Trennprinzipien) zwischen der Probe, der stationären Phase und der mobilen Phase werden einzelne Substanzen unterschiedlich schnell weitertransportiert und somit voneinander getrennt: Ein Gemisch aus Sand, sehr kleinen und etwas größeren Kieselsteinen wird an einer Stelle des Flusses eingebracht; nach beispielsweise hundert Metern kommt zuerst der gesamte Sand an (verteilt auf eine gewisse Zeit) und nach einer gewissen Wartezeit kommen alle kleineren Kieselsteine und noch viel später die größeren, jeweils zeitlich etwas auseinandergezogen.

Dieser Vergleich eignet sich für einen ersten Einstieg. Tatsächlich erinnert der Prozess (bei der Chromatographie) eher an einen „digitalen“ Prozess (engl. stop and go). Die Probemoleküle werden entweder mit der mobilen Phase mitgenommen (mit der Geschwindigkeit der mobilen Phase – Analogie wäre ein Floß, das passiv in einem Strom mitgeführt wird) oder sie haften an der stationären Phase (Geschwindigkeit gleich Null). Zwischen diesen beiden Möglichkeiten wechseln sie sehr rasch hin und her (aufgrund der Wärmebewegung erhalten sie ständig Stöße). Der Vergleich mit dem Flussbett könnte auch zu einem weiteren Missverständnis führen: die Verzögerungen, die die verschiedenen Probemoleküle auf dem Weg durch das chromatographische System erleiden, haben nichts mit Reibungsphänomenen zu tun. Basis für das Verständnis sind Unterschiede in der Verteilung (der verschiedenen Molekülsorten A, B, C usw.). Sie entsprechen Unterschieden im Zeitanteil (den die einzelnen Moleküle vom Typ A, B, C usw. im Mittel in der mobilen Phase verbringen). Die Chromatographie schafft es, diese Unterschiede in Geschwindigkeitsunterschiede zu verwandeln und damit für eine Trennung gut nutzbar zu machen. Das könnte man auch als den „Trick“ oder als das Prinzip der Chromatographie bezeichnen. Ansonsten wären diese oft recht kleinen Unterschiede kaum zu nutzen, weder für Trenn- und Reinigungsprozesse, noch für Analysen.

Anhand eines Beispiels ist es leichter zu verstehen: Wenn sich 45 % der A-Moleküle in der mobilen Phase aufhalten (im Mittel), kommt es auf Grund des dynamischen Gleichgewichtes dazu, dass die individuellen A-Moleküle auch 45 % der Zeit in der mobilen Phase verbringen (im Mittel). Daher wird ihre Geschwindigkeit 45 % der Geschwindigkeit der mobilen Phase betragen (im Mittel). Für gute Ergebnisse bei der Chromatographie ist es entscheidend, dass der Stoffaustausch zwischen den beiden Phasen sehr rasch erfolgt, das heißt die einzelnen Probemoleküle sollen sehr oft zwischen den beiden Phasen hin und her wechseln (Diffusionsprozesse, Wärmebewegung). Eine Voraussetzung dafür ist, dass die Wege, welche die Moleküle von der stationären Phase zur mobilen Phase zurückzulegen haben, sehr kurz sind. Falls die stationäre Phase ein Pulver enthält, sollte die Korngröße dieses Pulvers sehr klein sein (zum Beispiel nur wenige Mikrometer). Aus bestimmten Gründen sollten die Pulverkörner auch möglichst einheitlich geformt sein und eine möglichst einheitliche Größe aufweisen (enge Korngrößenverteilung).

Schematische Darstellung

Für die Chromatographie sind die Herstellung des Flusses der mobilen Phase, die Injektion der zu trennenden Probe, die eigentliche Trennung und die Detektion nötig. Das Fließen der mobilen Phase wird entweder mittels Druck (hydraulischen Pumpe, Gasdruck), Kapillarkraft oder durch Anlegen einer elektrischen Spannung erreicht.

Die Injektion (= Einbringen des Substanzgemisches in das chromatographische System) erfolgt entweder, bevor der Fluss der mobilen Phase hergestellt wird (z. B. Dünnschichtchromatographie) oder während die mobile Phase bereits fließt. Bei einer großen Anzahl von Proben werden bei automatisierbaren Chromatographiearten sogenannte Autosampler (zusammen mit eigenen Datenerfassungssystemen) eingesetzt, die vollautomatisch die Proben injizieren.

Anschließend erfolgt die eigentliche Auftrennung des Substanzgemisches auf der Trennstrecke. Ohne Detektion (= sichtbar machen, wann eine Substanz einen bestimmten Teil des Chromatographiesystems passiert oder wo eine Substanz nach dem Beenden des Prozesses zum Liegen kommt) ist eine Chromatographie nicht denkbar. Für jede Chromatographieart werden verschiedene Detektionssysteme eingesetzt, indem entweder physikalische Eigenschaften (Absorption von Licht, Fluoreszenz, Lichtstreuung, Wärmeleitfähigkeit.) der Substanzen ausgenutzt werden oder durch chemische Reaktionen ein Signal erhalten wird. Mittels chemischer Reaktionen wird z. B. eine Färbung bei der planaren Chromatographie erreicht (z. B. Aminosäuren mittels Ninhydrin) oder Reaktionen vor dem Auftrennen (Vorsäulenderivatisierung) oder nach dem Auftrennen (Nachsäulenderivatisierung) bei der Säulenchromatographie durchgeführt.

Bei der präparativen Chromatographie wird anschließend noch ein Fraktionensammler zum Auffangen der aufgetrennten Substanz benötigt.

Bauartbedingt handelt es sich bei chromatographischen Aufreinigungsverfahren immer um Batch-Verfahren. Dies bedeutet, dass immer nur eine bestimmte Menge an Substanz aufgetragen und getrennt werden kann, bevor mit der nächsten Menge fortgefahren werden kann. Dies ist insbesondere bei der Aufarbeitung großer Mengen problematisch, so dass einige Verfahren entwickelt wurden, um Chromatographie kontinuierlich betreiben zu können: Annulare Chromatographie, TMB (True Moving Bed) Chromatographie und SMB-(Simulated Moving Bed) Chromatographie.

Das grundlegende Prinzip aller chromatographischen Verfahren ist die oft wiederholte Einstellung eines Gleichgewichtes zwischen einer ruhenden Phase und einer bewegten Phase. Das Gleichgewicht kann sich auf Grund verschiedener physikalisch-chemischer Effekte ausbilden.

• Adsorptionschromatographie – Hier kommt es zu einer Trennung der verschiedenen Komponenten auf Grund der unterschiedlich starken adsorptiven Bindungen zur ruhenden Phase. Die bewegte Phase kann ein mehr oder weniger polares Lösungsmittel oder bei gasförmigen Stoffen ein Trägergas sein. Im Fall der Flüssigchromatographie stellt man sich einen Wettkampf zwischen den diversen Probemolekülen mit den Molekülen der mobilen Phase (Fließmittel, Laufmittel) um die Haftstellen auf der (großen) Oberfläche der stationären Phase vor.
• Verteilungschromatographie – Ähnlich dem Extraktionsverfahren wird hier die unterschiedliche Löslichkeit der zu trennenden Komponenten ausgenutzt. Bei der Chromatographie bleibt aber das Lösungsmittel als ruhende Phase auf einem Trägermaterial haften. Die bewegte Phase kann wieder eine Lösung oder ein Trägergas sein.
• Ionenaustauschchromatographie – Die bewegte Phase ist hier meist eine Lösung der zu trennenden Ionen. Die ruhende Phase ist ein fester Ionenaustauscher. Ionenaustauscher bilden zwischen den verschiedenen Ionen der bewegten Phase unterschiedlich stabile Bindungen aus.
  • Chelatbildner-Chromatographie ist eine spezielle Form der Kationenaustausch-Chromatographie. Die ruhende Phase bindet selektiv polyvalente Kationen über komplexbildende, funktionelle Gruppen. Die Selektivität für Schwermetall-Ionen gegenüber von Alkali- und Erdalkali-Ionen ist hoch.
• Siebwirkung – Bei der ruhenden Phase benutzt man Stoffe, die die Komponenten anhand ihrer Größe trennen. Im Wesentlichen unterscheidet man hier zwischen drei Verfahren.
  • Molekularsieb-Chromatographie
  • Gel-Permeations-Chromatographie (Gelfiltration)
  • Ausschluss-Chromatographie

Bei einem Sieb haben Teilchen „Vorteile“, die fein genug sind, um die Poren des Siebes zu durchdringen. Bei den entsprechenden Chromatographieverfahren ist es genau umgekehrt. Genügend feine Teilchen sind in der Lage, sich in die Hohlräume der stationären Phase zu „verirren“, sind daher langsamer unterwegs als Moleküle, die auf Grund ihrer Größe aus diesen Hohlräumen (mehr oder weniger oder zur Gänze) ausgeschlossen werden. Bei genügender Größe wandern sie unverzögert, da sie sich nur im bewegten Flüssigkeitsstrom aufhalten und nie im unbewegten Teil der Flüssigkeit (in den Hohlräumen – z. B. des Gels).

• Affinitätschromatographie – Als stationäre Phase wird eine für jeden Analyten spezifische chemische Verbindung eingesetzt, die auf Grund nichtkovalenter Kräfte eine Trennung bewirkt. Es handelt sich hierbei um eine hochselektive Methode.
  • IMAC (Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography) – Hierbei werden über Komplexbindungen Metallionen wie Fe, Co, Ga u. a. an eine Matrix gebunden. Die Trennung wird über die unterschiedlichen Wechselwirkungen zwischen dem Analyten und den Metallionen erreicht. Besonders bei der Aufreinigung von Proteinen durch Phosphorylierung hat sich diese Methode etabliert. Dabei werden als Metallionen vornehmlich Fe und Ga genutzt. Als Konkurrenzverfahren hat sich dort seit einiger Zeit die Anreicherung über Titandioxid-Säulen bewährt. Für die Aufreinigung von poly-Histidin-markierten Proteinen sind ebenfalls verschiedene IMAC-Verfahren vorhanden. Hierbei werden vor allem Ni und Co Ionen für die Anreicherung genutzt.
• Thiol-Disulfid-Austausch-Chromatographie verwendet auf der ruhenden Phase fest gebundene Thiol-Gruppen um die Thiol-Gruppen auf den Molekülen in der bewegten Phase als kovalente Disulfide reversibel zu binden. An diesen Bindungen beteiligen sich vor allem jene Thiol-Gruppen, die an der Außenseite der Proteinmoleküle liegen.
• Chirale Chromatographie – Zur Trennung von chiralen Molekülen. Die stationäre Phase enthält ein Enantiomer, das mit den beiden Enantiomeren des Racemats eine unterschiedlich starke diastereomere Wechselwirkung eingeht. Die beiden Enantiomere werden unterschiedlich stark retardiert.

Aufgrund der mobilen Phasen kann man die Chromatographie in drei Gebiete unterteilen, welche sich nach den Trägern der stationären Phasen oder der Dichte einteilen lassen

• Flüssigchromatographie (engl. liquid Chromatography, LC)
  • Planare Chromatographie
    • Papierchromatographie – Als feste Phase wird Papier verwendet, das entweder liegt oder (meist) senkrecht in einem Glasbehälter steht. Wie auch bei der Dünnschichtchromatographie wird die mobile Phase auf Grund der Kapillarkräfte bewegt.
    • Dünnschichtchromatographie – Als feste Phase werden z. B. Silikapartikel in einer feinen Schicht auf einer flexiblen Trägerfolie aus Aluminium oder Plastik oder einer Glasplatte aufgetragen. Eine Variante ist die zirkuläre DC, mit einer rotierenden, beschichteten Kreisscheibe (speziell für präparative Zwecke geeignet).
  • Säulenchromatographie
    • Niederdruckchromatographie – Die hier verwendeten Säulen weisen Durchmesser von einem bis mehreren Zentimetern auf. Diese Form der Flüssigchromatographie wird vor allem für präparative Trennungen eingesetzt.
    • Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (unrichtig, jedoch sehr gebräuchlich ist auch der Ausdruck Hochdruckchromatographie; engl. HPLC High Performance (Pressure) Liquid Chromatography) – Sie stellt die heute am weitesten verbreitete in der Analytik eingesetzte Trennmethode dar, die eigentlich unkorrekte (veraltete) Bezeichnung High Pressure Liquid Chromatography bezieht sich auf die Drücke, die diese Methode von der Niederdruck- oder anderen Chromatographiearten unterscheidet. Immerhin werden hier bis über 1000 bar bei einer Flussrate der mobilen Phase bis zu 5 ml/min erzeugt, die jedoch mit der Trennleistung nicht zu tun haben, sondern nur zur Fortbewegung des Eluentengemischs in der Säule dienen.
    • Elektrochromatographie – In diesem Fall wird die Mobile Phase durch Anlegen einer Spannung bewegt. Diese Methode befindet sich noch im Entwicklungsstadium und wird im Routinebetrieb nicht angewendet. Nicht zu verwechseln mit Elektrophorese.
  • Membranchromatographie
    • Hierbei wird statt einer mit chromatographischer Matrix gefüllten Säule eine ein- oder mehrlagige Membran als feste Phase in einem entsprechenden Gehäuse eingesetzt. Die mobile Phase wird bei niedrigen Drücken bis zu 6 bar und bei etwa 20-fach höheren Flussraten als in der Säulenchromatographie üblich durch die Membran gepumpt.
• Gaschromatographie
  • Gepackte Säulen – Das Innere einer Säule (lange Röhre) ist mit einem feinkörnigen Material gefüllt. In der Regel besteht dabei die stationäre Phase aus einem dünnen Film einer weitgehend inerten und hochsiedenden Flüssigkeit, der die Pulverkörner überzieht.
  • Kapillarsäulen – Nur die Säulenwand ist mit einer dünnen Schicht aus stationärer Phase bedeckt.
    • Flüssige stationäre Phase
    • Feste stationäre Phase
• Überkritische Fluidchromatographie (engl. SFC supercritical fluid chromatography) – Als mobile Phase wird eine Substanz in ihrer überkritischen Phase (Zustand zwischen Gas und Flüssigkeit) eingesetzt. Hierbei handelt es sich meist um Kohlendioxid. Bei dieser Methode werden nur Säulen als Träger von stationären Phasen eingesetzt.

• Säulenlänge ${\displaystyle L}$
• Durchflusszeit ${\displaystyle t_{0}}$
• Retentionszeit ${\displaystyle t_{R}}$
• ${\displaystyle u}$ nennt man die lineare Durchflussgeschwindigkeit der mobilen Phase durch die Säule, sie ist definiert als:

  ${\displaystyle u={\frac {L}{t_{0}}}}$

• der Retentionsfaktor ${\displaystyle k}$ ist definiert durch

  ${\displaystyle k={\frac {t_{R}-t_{0}}{t_{0}}}}$

• Der Selektivitätskoeffizient α gibt die Güte der Trennung zweier Substanzen an. Er beruht auf den Retentionszeiten ${\displaystyle t_{R}}$ der Komponenten in der Säule. Die Retentionszeit ist die Zeit, die die betrachtete Komponente zum Durchqueren der Säule braucht und wird am Peakmaximum abgetragen:

  ${\displaystyle \alpha ={\frac {k_{2}}{k_{1}}}}$

• ${\displaystyle R}$, die chromatographische Auflösung (Resolution) zweier Peaks errechnet sich aus:

  ${\displaystyle R=2\cdot \left({\frac {t_{R2}-t_{R1}}{b_{B2}+b_{B1}}}\right)}$ oder

  ${\displaystyle R=1{,}18\cdot \left({\frac {t_{R2}-t_{R1}}{FWHM_{1}+FWHM_{2}}}\right)}$

  Der Faktor 1,18 kommt durch das Verhältnis der Halbwertsbreite zur Basisbreite einer Gaußschen Glockenkurve ((2 · ln 2)^0,5) zustande.

• ${\displaystyle N}$, die Trennstufenzahl oder Bodenzahl beschreibt die Anzahl der Gleichgewichtseinstellungen, der zu trennenden Substanz zwischen stationärer und mobiler Phase, in der Säule. Je größer N, desto mehr Gleichgewichtseinstellungen können in einer bestimmten Länge erfolgen, woraus eine bessere Trennleistung der Säule resultiert. N wird berechnet mit Hilfe der Formel:

  ${\displaystyle N=16\cdot \left({\frac {t_{R}}{b_{B}}}\right)^{2}(2^{2}\cdot 4=16)}$ oder

  ${\displaystyle N=5{,}55\cdot \left({\frac {t_{R}}{FWHM}}\right)^{2}(1{,}18^{2}\cdot 4=8\cdot \ln 2=5{,}54)}$

  ${\displaystyle b_{B}}$ : Basislinienbreite

  ${\displaystyle FWHM}$ : „Full Width at Half Maximum“ Fwhm

• ${\displaystyle n}$: Peakkapazität; Gibt an, wie viele Peaks innerhalb eines Intervalls zwischen ${\displaystyle t_{0}}$ und dem k-Wert eines bestimmten Peaks theoretisch mit einer Auflösung von R=1,5 (Basislinientrennung) voneinander getrennt werden können.

  ${\displaystyle n=1+{\frac {\sqrt {N}}{4}}\cdot \ln(1+k_{\text{max}})}$

• ${\displaystyle H}$ bezeichnet die Trennstufenhöhe (oder theoretische Bodenhöhe) eines theoretischen Bodens (HETP - ‚Höhenäquivalent eines theoretischen Bodens‘, englisch ‚height equivalent to a theoretical plate‘) und ist das Verhältnis zwischen Säulenlänge ${\displaystyle L}$ und Bodenzahl ${\displaystyle N}$:

  ${\displaystyle H={\frac {L}{N}}}$

  Praktische Werte liegen im Bereich von 0,1 bis 0,5 mm.

Peaksymmetrie

Theoretisch sollte jede Substanz eine Chromatographiesäule als scharf eluierende Linie verlassen. Aus verschiedenen Gründen besitzen chromatographische Peaks jedoch immer eine gewisse Breite. Im Idealfall weisen sie dabei die Form einer Gauß’schen Glockenkurve auf. In der Praxis kommt es aber häufig vor, dass die Peaks von dieser Idealform abweichen und mehr oder weniger asymmetrisch erscheinen. Eine Asymmetrie, bei der der Frontanstieg des Peaks steiler ist als der Peakabfall, bezeichnet man als „Tailing“, während der Effekt, dass der Anstieg weniger steil ist als der Abfall als „Fronting“ oder auch „Leading“ bezeichnet wird. Der Tailingfaktor, der ein Maß für die Peaksymmetrie darstellt, wird bestimmt, indem man vom Peakmaximum das Lot zur Basislinie fällt, und in einer bestimmten Höhe, meist in 10 % der Peakhöhe, die Abstände zur Peakfront (a) und zum Peakende (b) ermittelt. Anschließend wird der Quotient der beiden Werte gebildet, wobei unterschiedliche Berechnungsformeln (z. B. nach IUPAC oder nach USP) in Gebrauch sind:

Drei Peaksymmetrien

Ein idealer „Gauß-Peak“ erreicht dabei den Wert 1, Werte über 1 bedeuten „Tailing“, Werte unter 1 dagegen „Fronting“.

• Flüssigchromatographie
  • Dünnschichtchromatographie
  • Papierchromatographie
  • Säulenchromatographie
    • Gel-Permeations-Chromatographie
    • Anionenaustauschchromatographie
• Gaschromatographie
• Frontalchromatographie
• Multidimensionale Chromatographie

• Karl Kaltenböck: Chromatographie für Einsteiger. Wiley-VCH-Verlag, Weinheim 2008, ISBN 978-3-527-32119-3.
• Haleem J. Issaq (Hrsg.): A Century of Separation Science. Marcel Dekker, New York 2002, ISBN 0-8247-0576-9 (englisch, eingeschränkte Vorschau in der Google-Buchsuche – umfangreicher Band über die Geschichte der Chromatographie).
• Andreas Heintz: Thermodynamik der Mischungen. Springer-Verlag GmbH, Deutschland 2017, ISBN 978-3-662-49923-8, 1.17 Thermodynamische Theorie der Chromatographie, S. 78 ff..

Wiktionary: Chromatographie – Bedeutungserklärungen, Wortherkunft, Synonyme, Übersetzungen

• Analytische Chemie – Chromatographie auf chemgapedia.de
• Umfangreiche Übersicht von Herstellern für LC-Systeme
• Deutsche chromatographische Grundbegriffe zur IUPAC-Nomenklatur (Memento vom 10. Juli 2007 im Internet Archive)