Immersion (Mikroskopie)

Prinzip der Auflösungssteigerung mit Immersionsmedium. Linke Seite Strahlengang mit Immersionsmedium (gelb), rechts ohne. Lichtstrahlen (schwarz) die vom Objekt (rot) kommen, und durch das Deckglas (orange, wie der Objektträger unten) treten, werden in einem bestimmten Winkelbereich nur dann vom Objektiv (dunkelblau) aufgefangen, wenn durch ein Immersionsmedium eine Brechung am Übergang vom Deckglas zur Luft verhindert oder zumindest verringert wird.

Die erzielbare Auflösung eines Objektivs und damit des ganzen mikroskopischen Systems hängt von seinem effektiven Öffnungswinkel ab: Je mehr Licht aufgefangen werden kann, das aus verschiedenen Richtungen das Präparat durchquert hat, desto größer ist der summierte Informationsgehalt und desto besser ist die erzielbare Auflösung. Diese wird für ein Objektiv als numerische Apertur (NA) angegeben. Die NA ist durch den Öffnungswinkel des Objektives und den Brechungsindex n des Mediums zwischen Objektiv und Präparat definiert.

${\displaystyle {\text{NA}}=n\cdot \sin \alpha }$

${\displaystyle \alpha }$ : halber Öffnungswinkel

${\displaystyle n}$ : Brechungsindex des Immersionsmediums bzw. von Luft.

Da Materialien in der Regel einen wellenlängenabhängigen Brechungsindex (Dispersion) aufweisen, wird zur einfacheren Beschreibung meist nur der Brechungsindex bei einer bestimmten Wellenlänge angegeben. Dies sind typischerweise n_e, der Wert bei 546,1 nm (Quecksilber-e-Linie), oder n_D, bei 589,3 nm (Natrium-D-Linie).

Beispiele:

• Luft: n_D = 1,000293.
• Wasser: n_e = 1,33.
• Glycerin: n = 1,47.
• Standard-Immersionsöl von Zeiss: n_e = 1,5180, n_D = 1,5151.
• Zum Vergleich: Deckglas-Glas: n_e = 1,5255, n_D = 1,5230.

Luft hat einen niedrigen Brechungsindex von näherungsweise 1. Wenn Licht aus wässrigen oder eingebetteten biologischen Präparaten in Luft übertritt, wird es daher durch die auftretende Brechung von der optischen Achse weggelenkt. Bei der Verwendung eines Deckglases tritt der gleiche unerwünschte Effekt am Übergang vom Deckglas zur Luft auf. Der Teil des Lichts, der so stark abgelenkt wurde, dass er vom Objektiv nicht mehr aufgefangen werden kann, ist für die Mikroskopie verloren und mit ihm sein Informationsgehalt.

Beim Mikroskopieren wird das Objekt meist mit einem Deckglas zugedeckt. Das Licht des Gegenstandes wird zuerst beim Übergang ins Deckglas gebrochen und dann nochmals beim Übergang in den Zwischenraum zwischen Deckglas und Objektiv. Beim zweiten Übergang kann es zur Totalreflexion kommen, wenn der Zwischenraum mit einem optisch dünneren Medium als Glas gefüllt ist. Die Menge an Licht, die ins optische System gelangt, wird dann vermindert. Durch Verwendung eines Immersionsöls, das etwa denselben Brechungsindex wie Glas hat, kann Totalreflexion vermieden werden.

Immersionsmedien haben einen deutlich höheren Brechungsindex als Luft, so dass die beschriebene unerwünschte Brechung weg von der optischen Achse nicht oder zumindest weniger stark auftritt. Mehr Licht und damit mehr Information kann vom Objektiv aufgefangen werden. Die Auflösung verbessert sich. Die Auflösungsgrenze, das heißt die kleinste auflösbare Struktur, kann beispielsweise nach dem Rayleigh-Kriterium bestimmt werden, welches zum Beispiel bei der Fluoreszenzmikroskopie Anwendung findet (siehe auch Auflösung (Mikroskopie)):

${\displaystyle d_{\mathrm {min} }={\frac {0{,}61\cdot \lambda }{\text{NA}}}}$

${\displaystyle \lambda }$ : Wellenlänge des verwendeten Lichts.

Die Auflösung hängt über die Numerische Apertur des verwendeten Objektivs vom Brechungsindex des Immersionsmediums ab. In der angegebenen Formel entspricht d dem Abstand, den zwei punktförmige, fluoreszierende Strukturen, die beide in der Schärfeebene (xy-Ebene) liegen, mindestens haben müssen, um als getrennte Strukturen aufgelöst werden zu können. Entlang der optischen Achse (z-Richtung) ist die Auflösung schlechter.

Trockenobjektive, also solche ohne Immersion, erreichen wegen des Brechungsindex von Luft maximal eine theoretische NA von 1 (bei sin α = 1, entsprechend einem Öffnungswinkel 2α von 180°) und praktisch eine NA von 0,95 (Öffnungswinkel 144°). Bei einem Ölimmersionsobjektiv mit einer Numerischen Apertur NA = 1,4 für Immersionsöl mit einem Brechungsindex 1,518 gilt: 1,4 = 1,518 · sin α. Daraus folgt der Öffnungswinkel 2α mit 134°.

Für das genannte Trockenobjektiv mit NA = 0,95 ergibt sich bei 500 nm Wellenlänge nach dem Rayleigh-Kriterium bei Fluoreszenzmikroskopie eine maximale Auflösung von 0,61 · 500 nm / 0,95 = 321 nm. Für das beschriebene Ölimmersionsobjektiv NA = 1,4 ergibt sich dagegen 0,61 · 500 nm / 1,4 = 217 nm. Wie erwähnt ist die in diesem Beispiel gewählte NA = 0,95 die maximal mögliche für Trockenobjektive. Bei einer NA von 0,5 des Objektivs würde sich ergeben: 0,61 · 500 nm / 0,5 = 610 nm.