Hefen

Die Gesamtmasse der heute produzierten Hefen einschließlich derer, die durch Brauen, Weinherstellung und Lebensmittelproduktion anfallen, beträgt Millionen Tonnen jährlich. Obwohl Hefen der Art Saccharomyces cerevisiae die wesentliche ökonomisch bedeutsame Form darstellen, gibt es zahlreiche „exotische“ Hefearten mit weiterem potentiellem Nutzen für technische Anwendungen. Die meisten Saccharomyces-Hefen gelten weltweit generell als sicher im Sinne des Lebensmittelrechts (GRAS – Generally Recognized As Safe) und produzieren zwei sehr wichtige primäre Stoffwechselprodukte, Ethanol und Kohlendioxid. Diese und andere Hefen werden über teils staatlich, teils privatwirtschaftlich organisierten Sammlungen für Hefen zur Verfügung gestellt, die Hefebanken; Beispiele sind die Hefebank Weihenstephan in Deutschland oder die National Collection of Yeast Cultures in Großbritannien.

Ethanol wird als Trinkalkohol, als Kraftstoff sowie als Lösungsmittel genutzt. Die Anwendung von Kohlenstoffdioxid reicht vom Backteig-Treiben, Zusatz zu Getränken, Produktion von Hopfenextrakt bis hin zur Anwendung in Gewächshauskulturen. Hinzu kommen weitere wichtige Anwendungen der Hefen selbst. Extrakte aus Hefen werden zum Würzen von Lebensmitteln verwendet und bieten als Nukleotidquelle einen wichtigen Bestandteil von Muttermilchersatzprodukten. Für Menschen und Tiere dienen Hefen als Vitamin-B-Quelle. Sterile Hefeextrakte dienen als Bestandteile von Nährmedien für die Kultivierung von Pilzen in der Enzymproduktion oder für die Produktion von Bakterien für Probiotika und Siliermittel.

Der Aufbau der Zellwand einiger Saccharomyces-Arten ist über das Aufzuchtmilieu (Gärführung, Ernährung) gezielt steuerbar, was diese Organismen in der Biotechnologiebranche sehr beliebt macht. Der gitterartigen Glucanfraktion der Zellwand einiger Stämme sind toxinbindende Eigenschaften nachgewiesen. Definierte Mannanoproteine ermöglichen die Bekämpfung pathogener Bakterien oder dienen als orale „Promoter“ von Vakzinen und Medikationen, Anwendungen, die auch für die Tierernährung interessant werden könnten. Die gut beschriebene Nährstoffsynthese von Hefen erlaubt die Herstellung von Aminosäuren und organisch gebundener Spurenelemente für die Human- und Tierernährung. Der Einsatz der Gentechnik führte zu zahlreichen anderen wichtigen Anwendungen von Hefen einschließlich Stämmen, die durch genetische Veränderungen nicht-hefetypische Proteine und Peptide wie Interferon, humanes Serumalbumin oder Insulin produzieren.

Hefen bestehen aus einer Vielzahl höchst unterschiedlicher Organismen und nicht nur aus der allgemein vom Backen oder Brauen bekannten Bäcker- oder Bierhefe Saccharomyces cerevisiae.

Hefen sind ideale Systeme für die Produktion von Fremdproteinen. Als Eukaryoten sind sie in der Lage, Proteine zu glykosylieren, sie sind also in der Lage, Zuckerketten an die Proteine anzuheften: viele Proteine sind Glykoproteine. Ferner sind sie in der Lage, diese Glykoproteine in das sie umgebende Nährmedium zu sezernieren – das Darmbakterium E. coli kann dies zum Beispiel nicht. Die in Hefen hergestellten Proteine sind damit identisch oder sehr ähnlich den Proteinen der Tiere oder des Menschen.

Die erste auf einer Hefeart beruhende „Expressionsplattform“ („Proteinfabrik“) nutzte die bereits erwähnte Bäckerhefe. Es gibt jedoch mehr als 800 verschiedene Hefearten mit höchst unterschiedlichen Eigenschaften. Einige davon sind für ihr Wachstum, im Unterschied zur Bäckerhefe, nicht auf Traubenzucker als Kohlenstoffquelle beschränkt, sondern können eine Vielzahl unterschiedlicher Substrate nutzen. Verschiedene dieser Hefen werden – wie die Bäckerhefe – für die gentechnische Herstellung von Proteinen genutzt.

Arxula adeninivorans ist eine dimorphe Hefeart (sie wächst in Hefeform unterhalb einer Temperatur von 42 °C, oberhalb dieser Temperatur in filamentöser Form). Sie kann auf höchst unterschiedlichen Energie- und Kohlenstoffquellen wachsen und Nitrat assimilieren. Sie wurde für die Produktion unterschiedlicher Proteine eingesetzt. Mit gentechnisch veränderten Stämmen wurde biologisch abbaubares Plastik hergestellt oder Biosensoren für die Messung von Östrogenen in Umweltproben.

Candida boidinii ist eine methylotrophe Hefeart (d. h., sie ist zum Wachstum mit Methanol-Oxidation als Energiequelle und Methanol als Kohlenstoffquelle fähig). Wie andere methylotrophe Hefearten (siehe nachfolgend Hansenula polymorpha und Pichia pastoris) bietet sie eine exzellente Plattform für die Produktion von Fremdproteinen. Für sie wurden Produktivitäten von vielen Gramm pro Liter Kultur beschrieben.

Hansenula polymorpha ist eine methylotrophe Hefeart (siehe Candida boidinii). Sie kann außerdem auf einer Vielzahl anderer Substrate wachsen, ist ein thermo-toleranter Mikroorganismus und kann Nitrat assimilieren. Sie wurde unter anderem für die Produktion von Hepatitis-B-Impfstoffen, von Insulin und Interferon-alpha2a für die Behandlung von Hepatitis C genutzt, darüber hinaus für die Herstellung verschiedener technischer Enzyme.

Kluyveromyces lactis (zuvor Saccharomyces lactis; Nebenfruchtform Candida sphaerica) ist eine mit der bekannteren Hefe Kluyveromyces marxianus (Candida kefyr) verwandte Hefeart, die unter anderem für die Produktion von Kefir eingesetzt wird. Sie kann mithilfe verschiedener Zucker wie insbesondere Glucose wachsen. Als Besonderheit kann sie die in Milch und Molke enthaltene Laktose zu Milchsäure fermentieren.[9] Sie wurde unter anderem nach gentechnischer Veränderung für die Produktion von Chymosin, dem Labferment und für die Dicklegung der Milch bei der Käseherstellung eingesetzt. Die Produktion des Chymosins findet in großen Fermentern im Maßstab von mehreren zehntausend Litern statt.

Pichia pastoris (Komagataella phaffii) ist eine weitere methylotrophe Hefeart (vergl. Candida boidinii und Hansenula polymorpha). Für diese „Plattform“ sind verschiedene Elemente als Kit erhältlich; sie wird weltweit in Universitäten und akademischen Einrichtungen für die Proteinproduktion eingesetzt. In jüngerer Zeit wurden Stämme entwickelt, die die komplexen Zuckerketten von menschlichen Proteinen völlig authentisch herstellen (Hefezuckerketten in Hefeproteinen sind normalerweise ähnlich, aber nicht völlig identisch).

Der Ausdruck „Hefe“ bezeichnet einen Sammelbegriff, wird aber oft nur für diese Hefeart, die traditionelle Bäcker- oder Bierhefe Saccharomyces cerevisiae, benutzt, weil dies die ursprüngliche Bedeutung des Wortes „Hefe“ ist. Saccharomyces cerevisiae wurde und wird unter anderem für die Herstellung von technischen Enzymen, aber auch von pharmazeutischen Wirkstoffen wie Insulin und Hepatitis B-Impfstoffen genutzt.

Yarrowia lipolytica ist eine dimorphe Hefeart (vergl. Arxula adeninivorans), die wie andere bereits beschriebene Arten auf unterschiedlichen Substraten wachsen kann. Ihr Potenzial Lipide als Kohlenstoff- und Energiequelle zu nutzen hat zu ihrer Namensgebung beigetragen. Außerdem ist Y. lipolytica ein Modelorganismus für „oleaginous yeast“, ein Begriff der Arten umfasst die mindestens 20 % ihrer Biomasse als Fett speichern.[10] Diese Fähigkeit macht sie besonders für industrielle Anwendungen von Fettderivaten interessant, z. B. wird die Omega-3-Fettsäure Eicosatriensäure (EPA) kommerziell in einem genetisch optimiertem Stamm hergestellt und als Nahrungsergänzungsmittel verkauft.[11] Bestimmte Stämme von Yarrowia lipolytica wurden auch für die biotechnische Produktion von Erythrit und Mannitol aus Glyzerin erprobt.[12]

Die diversen Hefe-Arten unterscheiden sich bei bestimmten Produktentwicklungen erheblich. Zudem müssen aus den so genannten Wildtypen zunächst „gentechnische Proteinfabriken“ werden. Geeignete Hefestämme müssen dazu mit Hilfe eines Vektors (konkret: mit Hilfe eines Plasmids) transformiert werden. Ein solches Plasmid enthält alle notwendigen genetischen Elemente für das Erkennen eines transformierten Stammes und die genetische Anleitung für die Produktion des gewünschten Proteins. Diese Elemente werden im Folgenden kurz zusammengefasst:

1. Ein Selektionsmarker, der notwendig ist, um einen transformierten Stamm von nicht-transformierten Stämmen zu unterscheiden – dies kann zum Beispiel durch ein genetisches Element erreicht werden, das einen defekten Stamm in die Lage zurückversetzt, in Medien zu wachsen, in denen ein unverzichtbarer Stoff fehlt, die der Stamm aufgrund seines Defektes selbst nicht mehr produzieren kann, etwa eine bestimmte Aminosäure.
2. Bestimmte Elemente, um die Plasmide nach Aufnahme zu vermehren oder in eine bestimmte Stelle des Hefechromosoms zielgerichtet einzubauen (ARS und/oder rDNA-Sequenz).
3. Ein DNA-Segment, das für die Synthese des erwünschten Proteins verantwortlich ist, eine so genannte Expressionskassette.

Grundstruktur eines Vektors: Dieser Basisvektor enthält alle Elemente für die Vermehrung im E. coli-System und eine Multicloning Site (MCS) für die Integration von Modulen für ARS, rDNA, Selektionsmarker und Expressionskassetten. Dazu wurden die ARS-Fragmente mit den Restriktionsorten für SacII und BcuI, die rDNA-Region mit BcuI und Eco47III, die Selektionsmarker mit Eco47III und SalI und die Promotor-Elemente mit SalI und ApaI flankiert.[13]

Eine Expressionskassette besteht aus einer Abfolge regulatorischer Abschnitte: zunächst enthält sie einen Promotor, durch den kontrolliert wird, in welchem Umfang und unter welchen Umständen eine nachfolgende Sequenz abgelesen (Transkription der mRNA) und damit, wie viel und unter welchen Umständen Protein hergestellt wird. Dies bedeutet, dass die nachfolgende Sequenz variabel entsprechend dem zu produzierenden Stoff ist. Sie kann zum Beispiel die Aminosäuresequenz für Insulin, Hepatitis B-Oberflächenantigene oder Interferon festlegen. Die Expressionskassette wird durch eine nachfolgende Terminatorsequenz begrenzt, durch die eine korrekte Beendigung der Transkription erfolgt. Die Promotorelemente für die Kontrolle der Transkription stammen von sehr aktiven Genen der einzelnen Hefearten, bei Hansenula polymorpha etwa von Genen des Methanolstoffwechsels. Sie sind stark und können darüber hinaus durch Zugabe bestimmter Kohlenstoffquellen in ein Kulturmedium reguliert werden. Die meisten der Promotoren sind wie die soeben benannten nur in einem einzigen System, nämlich dem, aus dem sie stammen, funktionstüchtig.

Es hat sich herausgestellt, dass die verschiedenen Hefearten höchst unterschiedlich in ihrer Fähigkeit sind, bestimmte Proteine zu produzieren. Es gibt dabei Unterschiede in der Prozessierung und Modifikation und generell in der Produktivität. Da sie sich unterscheiden, kann nicht ausgeschlossen werden, dass eine zu Beginn einer Prozess- und Produktentwicklung festgelegte Hefe überhaupt nicht oder nur unvollkommen in der Lage ist, den angestrebten Stoff zu produzieren. Dies wiederum kann kostenträchtige und zeitraubende Folgen haben. Es ist daher sinnvoll, zu Beginn einer Entwicklung mehrere Hefearten gleichzeitig auf ihre Fähigkeit zu überprüfen, ein bestimmtes Protein herzustellen. Zu diesem Zweck wurde ein Vektorsystem entwickelt, das in allen bisher untersuchten Hefen funktionstüchtig ist. Es ist modular aufgebaut, enthält eine „universelle“ Zielsequenz, die in allen Hefen in identischer Sequenz vorhanden ist (die rDNA). Innerhalb der Expressionskassette enthält es einen Promotor, der in allen Hefen aktiv ist.

Neben dem Einsatz von Bier- oder Brauhefe in abgetöteter Form als hoch verfügbarer Proteinquelle kommen seit etwa 20 Jahren spezifische Stämme von Saccharomyces cerevisiae in der Tierernährung als Probiotika zum Einsatz. Der Siegeszug dieser Anwendungsform insbesondere im Wiederkäuerbereich geht auf eine wesentliche Beobachtung aus dem Brauwesen zurück: Zur Stabilisierung des fertigen Jungbieres nutzen Brauer in dem Verfahren des „Kräusens“ eine kleine Hefegabe, die Restsauerstoff verbraucht. In diesem Zusammenhang beschrieb der britische Brauwissenschaftler James Hough 1965 bei dem Stamm S. cerevisiae NCYC 1026 ungewöhnlich hohe sauerstoffzehrende Aktivität. Sein Student, der irische Brauingenieur Pearse Lyons, nutzte 1980 diese Beobachtung erstmals kommerziell zur Stabilisierung des anaeroben Zustandes im Pansen von Kühen. Heute gehört der Einsatz lebender Hefekulturen in der Fütterung von Wiederkäuern und Pferden weltweit zum Standard.

Weitere für die Tierleistung und Gesundheit relevante Effekte gehen auf milieuprägende und bakterienstimulierende Eigenschaften der noch lebenden Hefen zurück. Verschiedene faserabbauende sowie laktatabbauende Bakterien reagieren auf die Anwesenheit der Hefen durch Erhöhung ihres Stoffwechsels und ihrer Fortpflanzungsaktivitäten. Die genutzten Eigenschaften sind wiederum für einzelne Saccharomyces-Stämme spezifisch. Ebenfalls bekannt sind Stämme mit gegenläufiger Wirkung, wie der Stimulation von Laktatbildnern.

Die Suche nach künftigen Anwendungen für Hefen in der Tierernährung konzentriert sich auf die Erzeugung natürlicher Hemicellulasen und Cellulasen für die Herstellung höherwertiger Proteine und einzelner Aminosäuren aus günstiger Rohware wie Reisschalen oder Nebenprodukten aus der Alkoholindustrie. Weitere Bereiche sind die Erzeugung von Peptiden für die balancierte Jungtierfütterung im Sinne „idealer Proteine“ und die Nutzung von Hefeprotein als Basis zur Chelatierung von Medikamenten und Spurenelementen. Die Zucht und Herstellung von Hefen vom gewünschten Typ erfordert viel Know-how, aber sie ist sehr vielseitig und vor allem sehr sicher. Saccharomyces cerevisiae und ihre Verwandten werden die Menschheit demnach noch lange begleiten.