Dunkelfeldmikroskopie

Als Durchlichtbeleuchtung wird in der Mikroskopie eine Anordnung bezeichnet, bei der die Beleuchtung vom Objektiv aus gesehen von der Rückseite des Präparats erfolgt, das Licht durch das Präparat durchtritt (Transmission) und schließlich in das Objektiv gelangt. Die normale Durchlicht-Mikroskopie, genauer: Durchlicht-Hellfeldmikroskopie, ist die am häufigsten in der Biologie und Medizin eingesetzte Variante[1], sie findet auch in Schulmikroskopen Anwendung.

Bei der klassischen Durchlicht-Hellfeldmikroskopie entsteht der Bildkontrast hauptsächlich dadurch, dass das Präparat einen Teil des eingestrahlten Lichts absorbiert und so der entsprechende Bereich dunkler erscheint (vergleiche Abbildung 1). Viele mikroskopische Objekte sind aber weitgehend durchsichtig oder sehr klein und absorbieren daher nur sehr wenig Licht. Sie erzeugen im Hellfeldmikroskop nur einen geringen Kontrast und sind somit vor dem hellen Hintergrund schlecht zu erkennen (vergleiche Abbildung 2 links). Derartige Objekte können Licht ablenken, also die Richtung einiger Lichtstrahlen durch Streuung, Beugung, Brechung und/oder Reflexion verändern. Unter Hellfeldbeleuchtung lassen sich diese Ablenkungen aber kaum feststellen, da die Helligkeit der abgelenkten Lichtstrahlen viel schwächer ist, als der hell erleuchtete Bildhintergrund. In gewissen Grenzen kann der Kontrast bei Hellfeldbeleuchtung erhöht werden, indem eine kleinere Blende im Strahlengang der Beleuchtung (Kondensorblende) gewählt wird (vergleiche Abbildung 2 Mitte). Gleichzeitig verstärken sich dadurch aber auch Abbildungsfehler und es entstehen am Rand der Objekte störende Beugungsmuster (vergleiche kleine Bildausschnitte in Abbildung 2).

Bei der Durchlicht-Dunkelfeldmikroskopie wird das Präparat von der Rückseite so beleuchtet, dass die Beleuchtung nicht direkt in das Objektiv gelangt, sondern nur das im Präparat abgelenkte Licht. Der Hintergrund des Bildes erscheint somit dunkel, während Objekte im Präparat hell erscheinen (vergleiche Abbildung 1 rechts). Dies funktioniert auch und besonders bei weitgehend transparenten Proben. Während die Helligkeitsunterschiede des abgelenkten Lichts wegen der hohen Lichtintensität der Hellfeldabbildung schwer zu erkennen sind, erscheinen diese Unterschiede in der Dunkelfeldabbildung deutlich stärker. Die feinen Fettspuren eines Fingerabdrucks in Abbildung 2 (rechts) sind daher klar zu erkennen. Die schon bei Hellfeldbeleuchtung erkennbaren Verunreinigungen (Partikel und Kratzer) zeigen im Dunkelfeld jedoch einen so starken Kontrast, dass sie im Bild nur noch als helle, überstrahlte Flecken abgebildet werden.

Bei Durchlicht-Dunkelfeldbeleuchtung ist es besonders wichtig, dass Objektträger, Deckglas und auch die Glasoberflächen im Mikroskop sauber sind, da jedes Staubkorn durch seine Ablenkung des Lichts zum Hintergrundrauschen beiträgt. Auch dürfen lichtablenkende Strukturen nicht in verschiedenen Ebenen übereinander vorkommen, da sich deren Signale sonst überlagern. Dementsprechend ist Dunkelfeldbeleuchtung nicht geeignet für dickere Präparate wie typische Gewebeschnitte.[1]

Physikalisch lässt sich Durchlicht-Dunkelfeldbeleuchtung als eine Beleuchtung beschreiben, bei der das Beugungshauptmaximum des Lichts (siehe Beugungsscheibchen) nicht in die hintere Brennebene des Objektivs gelangt. Nur abgelenktes Licht, beispielsweise durch Beugung entstandene Nebenmaxima, nehmen am Bildaufbau teil.[1][2]

Abbildung 3: 2-Euro-Münze unter Auflicht-Hellfeld- (links) und Auflicht-Dunkelfeldbeleuchtung (rechts). Dunkelfeldaufnahme mit geeigneter Ringbeleuchtung. Während im Hellfeld ein korrekter Farbeindruck entsteht, ist im Dunkelfeld die Struktur der Europakarte wesentlich besser zu erkennen.

Von Auflichtbeleuchtung spricht man in der Lichtmikroskopie, wenn das Licht von oben (genauer: von der Objektivseite aus) auf das Präparat fällt. Die Beleuchtung erfolgt entweder durch das Objektiv selbst hindurch oder durch eine eigenständige Beleuchtungseinrichtung, die seitlich oder um das Objektiv herum angeordnet ist. Der Winkel, in dem das Licht auf das Objekt fällt, bestimmt das Aussehen des Bildes. Wird ein Großteil des von der Probe gerichtet reflektierten Lichts vom Objektiv eingefangen, so erscheint das Objekt in der Abbildung hell (Hellfeldbeleuchtung). Erfolgt die Beleuchtung jedoch so weit von der Seite, dass das gerichtet reflektierte Licht am Objektiv vorbei strahlt, spricht man von Dunkelfeldbeleuchtung.

Bei Materialuntersuchungen ist die Hellfeld-Beleuchtung die am häufigsten verwendete Technik für die Ausleuchtung von rauen, wenig reflektierenden Objekten.[3] Die Auflicht-Hellfeldbeleuchtung entspricht der normalen Sehweise des Menschen: Glatte, stark reflektierende Oberflächen erscheinen aufgrund ihres starken Glanzes hell (Abbildung 3 links). Die Reflexion verleiht Metalloberflächen den typischen Glanz. Unterhalb von Glas oder anderen transparenten Oberflächen angeordnete Strukturen wären bei dieser Beleuchtungsart durch die starke Reflexion an der Oberfläche nur schlecht zu erkennen.

Bei Auflicht-Dunkelfeldbeleuchtung erscheinen glatte, stark reflektierende Flächen dunkel. Kanten und Oberflächendefekte wie Kratzer oder Auflagerungen leuchten jedoch hell (Abbildung 3 rechts). Diese werden stark hervorgehoben und können leichter erkannt, bzw. mit bildverarbeitenden Verfahren einfacher detektiert werden. Bei rauen, wenig reflektierende Oberflächen sorgt die seitliche Anordnung der Auflicht-Dunkelfeldbeleuchtung für lokale Schattenbildung, so dass Oberflächenstrukturen etwas plastischer wirken. Dieser Effekt kann durch eine einseitige Beleuchtung noch deutlich verstärkt werden.

Die Begriffe Dunkelfeld und Hellfeld lassen sich auch auf mikroskopische Verfahren übertragen, die zur Bilderzeugung kein Licht, sondern andere Signale verwenden. Es wird entsprechend unterschieden, ob nicht abgelenktes Anregungssignal vom Detektor registriert wird (Hellfeld), oder ob nur das von der Probe veränderte Signal zur Bildgebung beiträgt (Dunkelfeld). Mit Dunkelfeld bezeichnete Verfahren gibt es zum Beispiel in der Elektronenmikroskopie (siehe etwa Rastertransmissionselektronenmikroskop) und in der Akustischen Mikroskopie.[4]

Bessere Bildqualitäten werden bei zentriertem Kondensor mit Hilfe einer Zusatzeinrichtung erreicht. Diese Zusatzeinrichtung beschränkt die Beleuchtung des Präparats auf einen Kegelmantel (gelb in der Schemazeichnung rechts). Der innere Teil des Kegels enthält kein Licht (grau in der Schemazeichnung). Der vom Kondensor kommende Kegelmantel wird in die Präparatebene fokussiert und weitet sich im einfachsten Fall danach wieder, so dass nicht abgelenktes Licht vollständig an der Objektivöffnung vorbeigeht, der Bildhintergrund bleibt dunkel. Nur Licht, das durch die zu beobachtenden Objekte abgelenkt wird, gelangt in das Objektiv und erzeugt ein Bild mit hellen Strukturen auf dunklem Hintergrund. Alle heutigen Durchlicht-Dunkelfeldbeleuchtungen erzeugen einen Kegelmantel, jedoch treten diese nicht immer durch das ganze Präparat hindurch: In manchen Fällen kommt es zur Totalreflexion des nicht abgelenkten Lichts an der Deckglasoberkante.

Um den Beleuchtungskegelmantel zu erzeugen, werden zwei verschiedene Verfahren angewendet. Eine Zentralblende zur Erzeugung des Kegelmantels ist einfach in der Herstellung und Handhabung, preisgünstig und daher weit verbreitet. Dieses Verfahren eignet sich besonders für Objektive mit relativ geringer Vergrößerung, wobei die Dicke des Beleuchtungskegelmantels durch einfaches Wechseln der Blende optimal auf das verwendete Objektiv abgestimmt werden kann. Spezielle Dunkelfeldkondensoren erreichen durch Spiegeltechniken eine höhere Lichtausbeute und können durch Immersion auch den Anforderungen höher vergrößernder Objektive gerecht werden. Die Abbildungsqualität wird besser.

Wenn der Beleuchtungskegelmantel wie in der Schemazeichnung durch das Präparat hindurch tritt, so muss er außen am Objektiv vorbeigehen. Eine Dunkelfeld-Beleuchtung ist nur dann möglich, wenn der Winkel des aus dem Kondensor austretenden Lichts (Öffnungswinkel) größer ist als der Winkel des vom Objektiv aufgefangenen Lichts. Je größer der Öffnungswinkel eines Objektivs oder Kondensors, desto besser ist die maximal erzielbare Auflösung. Statt des Öffnungswinkels wird bei Objektiven und Kondensoren die numerische Apertur angegeben, die ohne Immersion bis zu 0,95 betragen kann und mit Ölimmersion bis etwa 1,4. Für Dunkelfeldbeleuchtung muss also die numerische Apertur des Kondensors höher sein als die des verwendeten Objektivs. Ohne Immersion des Kondensors ist die Anwendung daher auf Objektive mit einer numerischen Apertur von etwa 0,75 oder weniger beschränkt.[5] 40x-Objektive, die ohne Immersion verwendet werden, haben häufig eine numerische Apertur von 0,65.

Kegelmantel zur Dunkelfeld-Beleuchtung, erzeugt mit Zentralblende. Ein farbiger Objektträger wurde senkrecht in den Strahlengang gebracht, um den Beleuchtungsweg sichtbar zu machen. Die Beleuchtung kommt unten aus dem Kondensor und geht oben seitlich am Objektiv vorbei. Zur Betrachtung wird das Präparat so auf den Tisch gelegt, dass es sich am hellsten Punkt befindet.

Die Zentralblende, hier in Aufsicht, ist zentral lichtundurchlässig (schwarz), und am Rand durchlässig (gelb).

Hier wird eine ringförmige Blende in einem ansonsten normalen Durchlicht-Hellfeldmikroskop verwendet. Diese Zentralblende (1 in der oberen Schemazeichnung rechts) weist einen lichtdurchlässigen Rand oder Ring auf und reduziert damit die Beleuchtung mit Hilfe eines normalen Kondensors (2) auf einen Kegelmantel (3). Um den Öffnungswinkel des Kondensors optimal auszunutzen, wird ein möglichst weit außen liegender Teil des Kondensors verwendet. Je größer der Öffnungswinkel des verwendeten Objektivs ist, desto größer muss auch der Durchmesser der zentralen lichtundurchlässigen Fläche sein, die Beleuchtungsstärke verringert sich entsprechend. Vom Objekttisch mit dem Objektträger (4) ausgehend verläuft das Licht somit am Objektiv (6) vorbei. Nur von Strukturen im Präparat abgelenktes Licht (5) gelangt in das Objektiv. Die Zentralblende kann als Einschub unter die Kondensorlinse eines normalen Durchlichtmikroskops eingesetzt werden.[1][5][6]

Die weiter verbreitete Phasenkontrastmikroskopie beruht zwar auf einem völlig anderen optischen Phänomen, aber auch dort werden Blenden verwendet. Diese Ringblenden lassen sich manchmal als Dunkelfeldblenden zweckentfremden. Phasenkontrast-Ringblenden sind so angelegt, dass der Lichtkegel bei richtiger Einstellung in das Objektiv eintritt und nicht daran vorbei geht, wie dies für Dunkelfeld erforderlich ist. Daher lassen sich für ein gegebenes Objektiv nur solche Phasenkontrast-Ringblenden als Dunkelfeld-Blenden einsetzen, die eigentlich für Objektive mit deutlich größerem Öffnungswinkel (höherer numerische Apertur) gedacht sind. Beispielsweise eignet sich eine Phasenkontrast-Ringblende für ein 100x-Ölimmersionsobjektiv in der Regel als Dunkelfeldblende für 10x- und 20x-Trockenobjektive, da Ölimmersionsobjektive einen größeren Öffnungswinkel haben.[5]

Dunkelfeldkondensor in einer Zeichnung von 1910. Der Strahlengang ähnelt dem in einem moderneren Kardioid-Kondensor. Rote und grüne Linien sind zugefügt, um den im Original dargestellten Strahlengang hervorzuheben. Licht dringt von unten in den Glaskörper ein und wird an einer konvexen Spiegelfläche zunächst nach außen reflektiert. Dort trifft es auf eine konkave Spiegelfläche, die die Strahlen Richtung Präparat (P) lenkt. Der Objektträger (Q) liegt dem Kondensor direkt auf (mit Immersionsöl verbunden), so dass die Strahlen hier geradeaus laufen. Licht, das nicht im Präparat abgelenkt wird, geht am Objektiv vorbei. Für den grünen Strahl ist dies bei dieser Zeichnung nur dann der Fall, wenn zwischen Deckglas und Objektiv keine Immersionsflüssigkeit vorhanden ist: Dann wird er an der Deckglas-Luft-Grenze so gebrochen, dass er das Objektiv nicht erreicht.

Bei besonders hohen Ansprüchen an die Abbildungsqualität werden statt Zentralblenden spezielle Dunkelfeldkondensoren eingesetzt. Es gibt Trockendunkelfeldkondensoren und Immersionsdunkelfeldkondensoren, bei letzteren wird Immersionsöl oder Wasser zwischen den Kondensor und den Objektträger eingebracht. Dadurch ist eine höhere numerische Apertur und damit eine höhere Auflösung möglich. Auch liefert ein Immersionskondensor einen besseren Kontrast, da Reflexe an der Objektträgerunterseite und Kondensoroberfläche vermieden werden, die zu einer Aufhellung des Bildhintergrundes führen.[6] Seine Handhabung ist jedoch aufwändiger, auch weil Öl sorgfältige Reinigungsarbeiten erforderlich macht. Der Nachteil beider Dunkelfeldkondensorarten gegenüber einer Zentralblende ist der aufwändigere Wechsel zu einer Hellfeldbeleuchtung, da der Kondensor hierfür ausgetauscht werden muss. Trockendunkelfeldkondensoren sind für Objektive mit numerischen Aperturen bis zu 0,65 oder 0,75 geeignet, während Immersionskondensoren für Objektive mit numerischen Aperturen bis zu 1,2 verwendet werden können.[6][5]

Moderne Dunkelfeldkondensoren sind meist Kardioidkondensoren.[6][7] Hier leitet ein konvex gewölbter zentraler Spiegel das eintreffende Licht nach außen auf einen rundherum laufenden konkaven Spiegel, so dass der Kegelmantel erzeugt wird (siehe vergleichbare Zeichnung von 1910 rechts). Der konkave Spiegel hat idealerweise eine wie eine Kardioide geformte Oberfläche, daher der Name. Aus fertigungstechnischen Gründen wird diese Oberfläche jedoch als Kugelfläche ausgeführt, ohne dass dies zu nennenswerten Qualitätseinbußen führt. Ein Paraboloidkondensor hat dagegen die Form eines abgeschnittenen Paraboloids. Das Licht wird hier nur einmal abgelenkt, nämlich durch Totalreflexion (siehe Zeichnung von Wenhams Glasparaboloid weiter unten), wodurch wiederum ein rundum verlaufender Beleuchtungskegelmantel erzeugt wird.[6][7][8]

Um sicherzustellen, dass die numerische Apertur des Objektivs kleiner ist, als die des Kondensors, kann ergänzend ein Objektiv eingesetzt werden, bei dem über eine bewegliche Irisblende die numerische Apertur eingeschränkt werden kann. Der Öffnungswinkel des Objektivs kann damit optimal auf den Durchmesser des Beleuchtungskegels abgestimmt werden, um letzteren gerade noch ausblenden zu können.[5][8]

Kardioid- und Paraboloidkondensoren werden auch als katoptrische Dunkelfeldkondensoren bezeichnet, da in ihnen die Lichtablenkung durch Spiegelung erfolgt, während dies in den sogenannten dioptrischen Kondensoren durch Glaslinsen geschieht.[9]

Auch für Stereomikroskope sind Durchlicht-Dunkelfeld-Beleuchtungen verfügbar. Die Beleuchtungseinrichtung ist im Stativfuß untergebracht. Abgesehen von der eigentlichen Lichtquelle, z. B. einer Halogenlampe, werden eine zentrale Abdeckung und außen liegende, aufrecht stehende spiegelnde Oberflächen eingesetzt, um die Beleuchtung des Objekts mit einem Kegelmantel zu ermöglichen. Das Prinzip entspricht also in etwa dem oben beschriebenen Spiegelkondensor. Das Objekt wird auf eine Glasplatte gelegt, die den Stativfuß nach oben abschließt. Das Bild setzt sich zusammen aus Lichtstrahlen, die im Objekt durch Reflexion, Lichtbrechung oder Beugung abgelenkt wurden. Typischerweise kann die zentrale Abdeckung gegen eine Mattscheibe ausgewechselt werden, so dass neben Dunkelfeld auch Hellfeld-Durchlichtbeleuchtung möglich ist. Die außen stehenden Spiegel leiten dann zwar noch genauso viel Licht schräg auf das Präparat wie vorher, durch die sehr viel hellere Hellfeldbeleuchtung führt dies jedoch nicht mehr zu sichtbaren Effekten.[10]

Stereomikroskop von Wild Heerbrugg mit Durchlicht-Hellfeld und Durchlicht-Dunkelfeld-Beleuchtungseinrichtung im Gerätefuß. Bei Hellfeldbeleuchtung (Mitte) wird das Licht durch eine Mattscheibe gleichmäßig verteilt. Bei der Dunkelfeldbeleuchtung (rechts) schirmt eine Zentralblende den direkten Weg von der Lichtquelle zum Präparat ab. Nur über den zehneckigen äußeren Spiegel erfolgt eine kegelmantelförmige Beleuchtung. Die runde Glasplatte, auf die die Präparate gelegt werden, ist bei den beiden rechten Aufnahmen entfernt worden.

Beleuchtung nach Reade (1837), beschrieben von Queckett, 1852. Dargestellt sind links die Lichtquelle d, die Kondensorlinse c und rechts der Objekttisch a b mit Präparat e, nicht aber das Objektiv und weitere Mikroskopbestandteile.

Wenhams Glasparaboloid in einer Darstellung von P. Harting (1859). Die Beleuchtung kommt von unten, das Objektiv befindet sich oberhalb dieser Anordnung. Nachträglich zugefügte rote und grüne Linien verdeutlichen den eingezeichneten, von Wenham angenommenen Strahlengang mit Totalreflexion am Deckglas und Beleuchtung des Objekts von oben. a b, Deckglas. A B, Objektträger. C, Querschnitt des Glasparaboloids. c d, geschwärzte Platte, die den direkten Durchtritt von Licht verhindert. Bei o befindet sich das Objekt zwischen Deckglas und Objektträger.

Schon im 17. Jahrhundert wurde Dunkelfeldmikroskopie von Antoni van Leeuwenhoek, Robert Hooke und Christiaan Huygens angewendet, um Blutbestandteile oder Kleinlebewesen zu beobachten. Dabei wurden jedoch keine speziellen Gerätschaften eingesetzt. Vielmehr wurde die Lichtquelle, etwa eine Kerze, so positioniert, dass kein direktes Licht auf das Objektiv fiel.[5]

Schon mit einem sehr schräg gestellten Beleuchtungsspiegel ist Dunkelfeldmikroskopie möglich. Der Erste, der eine besondere Apparatur für die Dunkelfeldbeleuchtung beschrieb, war 1837 Joseph Bancroft Reade[11] (1801–1870), dessen Verfahren in John Quecketts „Practical treatise on the use of the microscope“ 1852 als Background Illumination bezeichnet wurde.[12] Die Lichtquelle wurde seitlich platziert, eine Sammellinse fokussierte das Licht so auf das Präparat, dass nicht abgelenktes Licht am Objektiv vorbei geleitet wurde. Im Laufe des 19. Jahrhunderts wurden von einer Reihe von Autoren weitere Beleuchtungsapparaturen entwickelt. Da Brechung an Glasoberflächen chromatische Aberration hervorruft, die bei Dunkelfeldmikroskopie besonders störend ist, wurden auch Spiegelkondensoren entwickelt, da bei Spiegelung dieser Fehler nicht auftritt. Die Spiegelung wurde entweder durch reflektierende Oberflächen erreicht, oder durch Totalreflexion.[13][14]

Francis Herbert Wenham (1824–1908) beschrieb zwischen 1852 und 1856 in mehreren Arbeiten verschiedene Dunkelfeld-Beleuchtungsprinzipien. Neben einer seitlichen Beleuchtung (mit Wirkung ähnlich wie bei Reade) gehörten Kondensoren für eine zentral positionierte Beleuchtungsquelle dazu, darunter ein hohler, versilberter Paraboloid und ein massiver Glasparaboloid, in dem die Reflexion durch Totalreflexion zu Stande kam (siehe Abbildung). Hierbei hatte der Objektträger direkten Kontakt mit dem Kondensor. Das Präparat war in Kanadabalsam oder Flüssigkeit eingebettet. Zwischen dem Deckglas und dem Objektiv war Luft. Das Prinzip der Beugung, das wesentlich für eine effektive Dunkelfeldbeleuchtung kleiner Objekte ist, war damals noch nicht verstanden. Wenham nahm daher an, dass die beobachteten Effekte darauf zurückzuführen seien, dass das Objekt von oben beleuchtet wurde, nämlich durch Licht, das von der oberen Deckglaskante durch Totalreflexion auf das Präparat zurückgeworfen wurde.[15][13][14]

Bis zum Ende des 19. Jahrhunderts wurde Dunkelfeldmikroskopie zwar von Amateuren, aber wenig im wissenschaftlichen Bereich eingesetzt, da sie nicht mit höher auflösenden Objektiven (mit hoher numerischer Apertur) funktionierte. Durch die Arbeiten von Ernst Abbe wurden Ende des 19. Jahrhunderts die optischen Grundlagen wie die Beugung verstanden. Dies nutzte W. Gebhardt bei Zeiss, indem er für die Dunkelfeldbeleuchtung eine Zentralblende für den Abbe’schen Beleuchtungsapparat vorschlug, die Zeiss 1898 ins Programm nahm. Wurde Immersion zwischen Kondensor und Objektträger verwendet, konnten Trockenobjektive mit einer Apertur bis zu 0,95 eingesetzt werden. Zeitweise wurde diese Zentralblende bei allen entsprechenden Geräten mitgeliefert, da sie jedoch bei den Kunden wenig Anklang fand, wurde dies wieder eingestellt. Die Firma Wiener Mikroskopfirma Reichert bot eine ähnliche Lösung an.[13]

Durch die Entdeckung des Syphilis-Erregers erlebte die Dunkelfeldmikroskopie ab 1906 einen Aufschwung, da sie eine gute Darstellung lebender Spirochäten ermöglichte, zu denen der Erreger gehört. Mehrere große Mikroskopfirmen entwickelten verbesserte Dunkelfeldkondensoren. Der von Karl Reichert enthielt eine Zentralblende mit veränderlicher Größe. Henry Siedentopf entwickelte 1907 für Zeiss einen Paraboloid-Kondensor. Das Design entsprach zwar dem Glasparaboloid von Wenham mit einer Abdunklung im Zentrum der unteren Seite des Paraboloids, durch verbesserte Fertigungstechniken konnte die optische Qualität jedoch so gesteigert werden, dass die innere und äußere Apertur des Beleuchtungskegelmantels 1,1 und 1,4 betrugen. Auf Grund der Arbeiten Abbes war klar, dass die Beugung entscheidenden Anteil an der Bildentstehung hat und dass die Totalreflexion am Deckglas lediglich hilft, den Eintritt von nicht abgelenktem Licht ins Objektiv zu vermeiden.[16] Bei einer späteren Ausführung, dem sogenannten Helldunkelfeldkondensor, konnte die zentrale Abdunklung über einen Hebel entfernt werden, so dass ein schneller Wechsel zwischen Dunkel- und Hellfeld möglich war.[2]

Bisher beschriebene Ansätze beruhen darauf, dass die Beleuchtung des Präparats mit einer höheren numerischen Apertur, also mit einem breiteren Winkel, erfolgt, als sie vom Objektiv aufgenommen werden kann. Aber auch der umgekehrte Ansatz ist möglich: Das Präparat wird mit einem vollständigen Kegel einer geringen numerischen Apertur (beispielsweise 0,2) beleuchtet. Hierbei lassen sich auch höchstauflösende Objektive einsetzen, denn die numerische Apertur und damit der Öffnungswinkel können beliebig groß sein, sie müssen allerdings deutlich größer sein als die der Beleuchtung. Das im Präparat nicht abgelenkte Licht wird dann im Objektiv nur einen zentralen Bereich einnehmen, während der äußere Bereich frei von direktem Beleuchtungslicht bleibt. Das nicht abgelenkte Licht wird quasi nachträglich im oder hinter dem Objektiv an einer geeigneten Stelle im Strahlengang entfernt. Dies wurde als „konaxiale Anordnung“ oder als „Zentrales Dunkelfeld“[13] bezeichnet und zu den ultramikroskopischen Methoden (siehe unten) gezählt. Nachteil dieses Ansatzes ist, dass im Präparat wesentlich höhere Lichtstärken erreicht werden als beispielsweise bei einer Zentralblende im Kondensor, wodurch in Präparaten mit vielen Objekten störende Nebenbeugungsbilder entstehen.[13][5]

Henry Siedentopf verwendete für ein derartiges von ihm entwickeltes System ein Objektiv, bei dem die sonst halbkugelförmige Rückseite der Frontlinse (der erste Glaskörper im Objektiv) flach geschliffen und schwarz lackiert war. Carl Metz (1861–1941)[17] bei Leitz entwickelte 1905 ein System mit Ölimmersionsobjektiven, bei dem eine Stempelblende (auch: Trichterblende) von der Rückseite beweglich in das Objektiv eingeführt wurde. Dadurch war es möglich, das gleiche Objektiv ohne diese Blende für Hellfeld-Anwendungen einzusetzen, ohne dass Helligkeitsverluste auftraten. Dafür war die Justierung schwierig.[13]

Der „Leitz-Sarg“, das erste Logo von Leitz

Wladimir Sergejewitsch Ignatowski entwickelte für Leitz einen Dunkelfeldkondensor, der zwei spiegelnde Oberflächen besaß aber einfacher zu handhaben war als frühere entsprechende Modelle (siehe Schemazeichnung von 1910 weiter oben). Er wurde ab 1907 verkauft. Die Querschnittszeichnung des von Felix Jentzsch entwickelten Nachfolgemodells von 1910 wurde Vorlage für ein Leitz-Logo, den sogenannten Leitz-Sarg.

Auch Henry Siedentopf bei Zeiss entwarf einen Kondensor mit zwei spiegelnden Flächen, der dem weiterentwickelten Kondensor von Ignatowski sehr ähnelte. Aus theoretischen Gründen sollte die zweite spiegelnde Oberfläche einem Ausschnitt einer Kardioiden entsprechen. Kardioide Oberflächen waren aber nur schwierig herzustellen. Stattdessen wurde eine kugelige Oberfläche verwendet, die innerhalb der Fertigungstoleranzen den gleichen Effekt hervorrief. Trotzdem wurde das Gerät von Zeiss als Kardioidkondensor vermarktet.[13]

Auflicht-Dunkelfeldbeleuchtung. Ein Beleuchtungsmantel (1) wird über Spiegel (2) in den äußeren Teil eines speziellen Objektivs geleitet und dort gespiegelt (3), so dass das Licht das Präparat (4) mit einem Kegelmantel beleuchtet. Die Linsen im Objektiv (türkis) nehmen auf der Präparatoberfläche abgelenktes Licht (olivbraun) auf.

Bei der Auflichtmikroskopie wird das Licht von derselben Seite aus eingestrahlt, von der aus auch beobachtet wird. Dieses Verfahren wird bei lichtundurchlässigen Materialien angewendet, beispielsweise bei Mineralien oder bei Werkstoffprüfungen. Bei Auflicht-Hellfeldbeleuchtung kann die Beleuchtung über den gleichen Objektivstrahlengang eingespeist werden, mit dem auch beobachtet wird.

Bei Auflicht-Dunkelfeldbeleuchtung sind Beleuchtungs- und Beobachtungsstrahlengang dagegen getrennt: Spezialobjektive haben einen zusätzlichen äußeren Bereich, der dem Beleuchtungsstrahlengang vorbehalten ist (siehe Schemazeichnung). Der innere Bereich entspricht einem normalen Objektiv, bei Dunkelfeldbeleuchtung dient er ausschließlich der Beobachtung. Der äußere Bereich entspricht dem Kondensor. Hier wird das Licht (1 in der Zeichnung) durch einen ringförmigen Hohlspiegel im äußeren Bereich (3) schräg auf das Präparat (4) geleitet. Wäre das Präparat ein flacher Spiegel, so würde das dort reflektierte Licht vollständig am inneren Bereich des Objektivs vorbeigeleitet: Das Bild bliebe dunkel. Von Oberflächenstrukturen wie Kratzern abgelenktes Licht wird dagegen vom Objektiv aufgenommen (5).[19][20]

Bei einigen Auflicht-Dunkelfeld-Objektiven ist es möglich, einzelne Sektoren des Beleuchtungsrings ein- oder auszublenden. Dadurch kann eine Schattenbildung verstärkt werden, so dass Strukturen, die in bestimmten Richtungen verlaufen, besser erkannt werden können. Bei sogenannten Ultropak-Beleuchtungseinrichtungen kann der ‚Kondensor‘, der um das Objektiv angebracht ist, in der Höhe verschoben werden, um unterschiedliche Ebenen im Präparat maximal zu beleuchten. Bei geringen Vergrößerungen lässt sich die erforderliche Lichtstärke auch durch eine seitlich aufgestellte externe Lichtquelle erreichen, beispielsweise Faseroptik-Leuchten.[21]

Oberflächenstrukturen wie zum Beispiel Kratzer heben sich im Auflicht-Dunkelfeld deutlich vom Hintergrund ab, da an ihnen reflektiertes oder gestreutes Licht teilweise in den zentralen Bereich des Objektivs gelenkt wird. Derartige Strukturen sind im Bild daher hell auf dunklem Hintergrund. Entsprechend ist Auflicht-Dunkelfeldbeleuchtung besonders geeignet für die Untersuchung von Oberflächen, etwa in den Materialwissenschaften. Dunkelfeldbeleuchtung ist bei Auflichtmikroskopen weit verbreitet. Im Gegensatz zur Durchlicht-Dunkelfeldbeleuchtung kann Auflicht-Dunkelfeldbeleuchtung auch mit den stärksten Objektiven eingesetzt werden. Um unerwünschte Reflexionen zu vermeiden, wird nach Möglichkeit ohne Deckglas gearbeitet.[19][21]

Bei Stereomikroskopen kann Auflicht-Dunkelfeld realisiert werden, indem die Beleuchtung eher streifend zur Oberfläche erfolgt und das gerichtet reflektierte Licht das Objektiv nicht direkt erreicht. Dies ist zum Beispiel möglich durch leichte Kippung eines flachen Präparats oder eine geschickte Anordnung frei positionierbarer Lichtquellen (z. B. Schwanenhalsbeleuchtung mit einer langen, biegbaren Halterung). Für ringförmige, allseitige Dunkelfeldbeleuchtung gibt es spezielle Ringleuchten mit einem Abstrahlwinkel von beispielsweise 60°, die in einem geringen Abstand von nur 5–15 mm oberhalb der Probe angeordnet sind.[22][23] Der zugehörige Dunkelfeld-Adapter (höhenverstellbarer Tubus) erlaubt eine Montage am Objektiv und vermeidet Streulichteinstrahlung.[24] Ein Beispiel für eine mit einer derartigen Beleuchtung aufgenommenen Probe ist die Abbildung der rechten 2-Euro-Münze im obigen Abschnitt Hell- und Dunkelfeld bei Auflichtbeleuchtung. Bei Stereomikroskopen wird Auflicht-Dunkelfeldbeleuchtung teilweise als Standardbeleuchtungsart gesehen.[25]

Bei gering reflektierenden Objekten entsteht durch die Dunkelfeldabbildung je nach Einfallswinkel eine mehr oder weniger plastische Darstellung.[25] Extreme Dunkelfeldbedingungen lassen sich mit einem Linienlicht realisieren, das ein Lichtband erzeugt, das unter einem extrem flachen Beleuchtungswinkel von einer Seite über die Oberfläche streift. Durch die Schattenbildung entstehen sehr kontrastreiche Aufnahmen selbst von geringen Höhenunterschieden. Fingerabdrücke lassen sich so einfach auf flachen, ebenen Oberflächen darstellen.[24]

Schemazeichnung eines Geräts für Sidestream Dark Field Imaging, unten der Bereich mit Objektiv und Beleuchtungseinheit

Darstellung der Mikrozirkulation mit Sidestream Dark Field Imaging. Die Blutgefäße heben sich dunkel vor dem hellen Hintergrund ab, da in ihnen das Licht absorbiert wird.

Als sidestream dark field imaging (abgekürzt SDF, zu deutsch: Seitenstrom-Dunkelfeld-Bildgebung) wird ein Verfahren zur Untersuchung der Mikrozirkulation bezeichnet, also zur Untersuchung kleiner und kleinster Blutgefäße. Das Verfahren wird mit einem kleinen Gerät durchgeführt, mit dem solche Gefäße bei Patienten zum Beispiel unter der Zunge untersucht werden können, wo keine störenden Hautschichten vorhanden sind. Die Technik verwendet einen zentralen Lichtleiter, in dem eine Linse das Bild des Präparats auf einen Kamerachip projiziert. Aus einem Ring um den zentralen Lichtleiter herum wird das Licht von grünen Leuchtdioden (Wellenlänge 530 nm) auf das Präparat eingestrahlt.[26][27]

Durch die Streuung im Präparat kommt es zu einer gleichmäßigen Verteilung des Lichts im beobachteten Bereich, so dass eine Art Hintergrundbeleuchtung entsteht. Das Hämoglobin in den roten Blutkörperchen absorbiert grünes Licht sehr stark, so dass sich die Blutgefäße, die dicht mit roten Blutkörperchen gefüllt sind, als dunkle Strukturen vor einem erhellten Hintergrund abheben. Die maximale Eindringtiefe ins Gewebe liegt bei 500 Mikrometern.[26][27]

Gewebeschnitt nach radioaktiver RNA-in-situ-Hybridisierung und Nachweis der Radioaktivität durch Entstehung von Silberkörnern. Bei Hellfeld-Mikroskopie (links) sind die Silberkörner nicht zu sehen, da sie zu klein sind um ausreichend Licht zu absorbieren. Beim gleichen Bildausschnitt bei Dunkelfeldmikroskopie (rechts) treten sie dagegen als helle Signale deutlich hervor, etwa unter dem Pfeil bei t. Der Maßstabsbalken ist 100 µm lang.

Die Stärke eines Signals ist bei der Dunkelfeldmikroskopie nicht von der Größe einer Struktur abhängig, sondern davon wie stark das Licht von ihr abgelenkt wird. Daher können mit ihr, ähnlich wie mit der Fluoreszenzmikroskopie, auch manche Partikel oder Strukturen nachgewiesen werden, die kleiner sind als die Auflösungsgrenze des jeweiligen Mikroskops. Allerdings kann dann nicht unterschieden werden, ob das Signal von nur einer oder mehreren, dicht beieinander liegenden Strukturen kommt. Auch entsteht kein Abbild, sondern eine als Punktspreizfunktion bezeichnete Beugungserscheinung, deren Größe wiederum von der Auflösung des Mikroskops abhängt.[6]

Die Form der Teilchen (rund, länglich, kantig …) spielt für die Form und Größe der erzeugten Beugungserscheinung keine Rolle, so dass die Form der Teilchen nicht feststellbar ist. Für kleinere Teilchen nimmt allerdings die Intensität ab, da an ihnen weniger Licht abgelenkt wird. Daher ist für diese eine starke Beleuchtung erforderlich. Die Intensität ist auch abhängig vom Unterschied in der optischen Dichte (Brechungsindex) zwischen Struktur und umgebenden Medium, da bei größeren Brechungsindexunterschieden mehr Licht abgelenkt wird.[6]

Dunkelfeldbeleuchtung wird im Rahmen des Millikan-Versuchs genutzt, bei dem die Dunkelfeldtechnik die Beobachtung von Öltröpfchen in einem Kondensator ermöglicht.[28] Für die Bestimmung der Elementarladung eines Elektrons durch dieses Experiment erhielt Robert Andrews Millikan im Jahr 1923 den Nobelpreis für Physik.

Auch zum Nachweis von Metallpartikeln in Gewebeschnitten kann die Dunkelfeldmikroskopie genutzt werden[29] (siehe auch Abbildung).

Um das Jahr 1900 herum kam der Begriff „Ultramikroskopie“ auf, mit dem die dunkelfeldmikroskopische Untersuchung sogenannter „Ultramikronen“ bezeichnet wurde, Partikel kleiner als die Auflösungsgrenze des Lichts, also kleiner als 0,2 Mikrometer.[13] Die minimale Größe solcher Partikel, die man bereits 1902 mit hellem Sonnenlicht in Goldrubingläsern mit Hilfe des Ultramikroskops bestimmte, liegt bei unter vier Nanometern.[30]

Das von Henry Siedentopf und Richard Zsigmondy entwickelte Spaltultramikroskop wurde für die Untersuchung von Kolloiden eingesetzt, für biomedizinische Untersuchungen war es nicht geeignet. Die Beleuchtung erfolgte in Form einer Ebene, die seitlich in das Präparat eingekoppelt wurde, ähnlich wie bei der moderneren Technik der Lichtscheiben-Mikroskopie (SPIM), bei der Laser verwendet werden und auch Fluoreszenz angeregt werden kann. Zur Erzeugung der Ebene wurde beim Ultramikroskop ein Spalt vor der Beleuchtungsquelle platziert, dessen Kanten nur einige Hundertstel Millimeter auseinander lagen. Dieser Spalt wurde durch ein Linsensystem etwa 50-fach verkleinert und schließlich ins Präparat abgebildet. Die Firma Zeiss bot Spaltultramikroskope inklusive Zubehör 1910 für 474,50 Mark (für Kolloide in Flüssigkeiten) beziehungsweise 744,50 Mark (Kolloide in festen Materialien) an.[13][31] Um besonders Nanopartikel in Flüssigkeiten beobachten und deren Verhalten studieren zu können entwickelte Richard Zsigmondy das Spaltultramikroskop in Göttingen zusammen mit der Firma R. Winkel GmbH weiter und stellte 1912 das Immersionsultramikroskop vor.[32]

Beim 1903 entwickelten, vereinfachten Ultramikroskop von Cotton und Mouton kam eine völlig andere Beleuchtungsgeometrie zum Einsatz. Ein Lichtkegel wurde seitlich in ein Glas-Prisma mit Parallelogramm-Seitenflächen eingespeist. An der Unterseite des Glaskörpers entstand Totalreflexion, wodurch das Licht zum Präparat geleitet wurde. Der Objektträger wurde mit Immersion direkt auf den Glaskörper gelegt. Die Lichtstrahlen trafen nun so schräg auf das Präparat, dass an der Oberkante des Deckglases ebenfalls Totalreflexion hervorgerufen wurde und kein direktes Licht auf das Objektiv traf. Nur im Präparat gebeugtes Licht wurde aufgenommen. Dieser Aufbau konnte nicht mit Immersionsobjektiven verwendet werden, da sonst am Deckglas keine Totalreflexion stattfand.[13]