Blutagar

Für die schnelle Zubereitung von gebrauchsfertigen Petrischalen mit dem Nährmedium Blutagar wird häufig eine fertige Mischung der getrockneten Bestandteile – mit Ausnahme des Blutes – verwendet. Derartige Granulate oder Pulver enthalten beispielsweise (Angaben in g/l):[2][3]

• Herz-Infus 10,0
• Pepton aus Fleisch 10,0
• Natriumchlorid 5,0
• Agar-Agar 15,0

Die Zahlenangaben geben die Massenkonzentration der Bestandteile (in Gramm pro Liter) im mit Wasser angesetzten Nährmedium wieder. Der pH-Wert soll bei 7,3 liegen.[2] Entweder erfolgt anschließend der Zusatz von Blut oder das Nährmedium kann auch ohne diesen Zusatz für die Kultivierung von anspruchsvollen Mikroorganismen verwendet werden,[2] allerdings lässt sich dann keine Hämolyse erkennen.

Nachdem das Basis-Nährmedium (siehe oben) auf eine Temperatur unter 50 °C abgekühlt ist, wird ein bestimmtes Volumen an defibriniertem Blut eingemischt und das Nährmedium in Petrischalen abgefüllt. Die empfohlene Blutmenge liegt meist bei 50–80 ml[3] (bezogen auf einen Liter Blutagar) bzw. soll einen Anteil von 5–10 % im fertigen Medium erreichen.[2] In der Regel wird Schafblut[2][3][4] oder Kaninchenblut[2] verwendet. Der pH-Wert soll nach Blutzugabe bei 6,8 liegen, damit die Erythrozyten erhalten bleiben.[3] Der abgefüllte, erstarrte Blutagar kann – kühl gelagert – bis zu drei Monate verwendet werden.[3]

Statt des Basis-Nährmediums mit Herz-Extrakt kann auch ein Nährmedium auf der Basis von Soja-Trypton verwendet werden.[4] Für die Kultivierung einiger Bakterien wird eine abweichende Herstellung empfohlen. So gelingt die Isolierung von Mycobacterium tuberculosis und anderen Erregern der Tuberkulose aus Sputum mit einem Blutagar, der 3,0 % Humanblut, 0,1 % Glycerin und Penicillin enthält.[5]

Kolonien von Neisseria gonorrhoeae auf Kochblutagar

Der Kochblutagar (wegen seiner Farbe auch fälschlicherweise Schokoladenagar genannt)[6] ist eine Variante des Blutagars, bei dem durch kurzzeitiges Erhitzen des mit Blut vermengten Mediums auf 80 °C[3] eine Lyse der Erythrozyten erreicht wird. Durch die Lyse werden Hämin („Faktor X“) und NAD⁺ („Faktor V“) in das Nährmedium freigesetzt, wodurch sich der Agar mittelbraun färbt.[6] Die freigesetzten Wachstumsfaktoren können dort von Bakterien verstoffwechselt werden, die selbst nicht hämolysierend sind (z. B. Haemophilus influenzae).[7] Kochblutplatten werden manchmal in einer Atmosphäre mit erhöhter CO₂-Konzentration bebrütet, besonders capnophile Keime, also CO₂-bevorzugende Bakterien, sowie sämtliche Neisseria vermehren sich so wesentlich besser.

1966 wurde über die Entwicklung eines Nährmediums mit einer neuen Blutagar-Zusammensetzung berichtet, die als Columbia-Agar oder Columbia-Blutagar bezeichnet wurde.[8] Häufig wird sie als Columbia-Agar mit 5 % Schafblut (englisch: Columbia agar with 5 % sheep blood) verwendet und bietet den Vorteil, dass die Kolonien der Bakterien auf diesem Blutagar schneller heranwachsen und größer sind im Vergleich zu anderen Blutagar-Nährmedien.[7] Das verbesserte Wachstum der Bakterien wird auf die Verwendung von zwei unterschiedlichen Peptonen und Hefeextrakt als Quelle für B-Vitamine zurückgeführt.[7]

Ein derartiges Nährmedium besteht meistens aus (Angaben in Gramm pro Liter):[7]

• Pankreatisch abgebautes Casein 12,0
• Peptisch abgebautes Tiergewebe 5,0
• Hefeextrakt 3,0
• Rindfleischextrakt 3,0
• Maisstärke 1,0
• Natriumchlorid 5,0
• Agar-Agar 13,5
• defibriniertem Schafblut 5 %

Kolonien von Staphylococcus aureus auf Columbia horse blood agar

Statt Schafblut kann auch Pferdeblut verwendet werden, das so erhaltene Nährmedium wird z. B. als Columbia-Agar mit 5 % Pferdeblut (englisch: Columbia agar with 5 % horse blood oder einfach nur Columbia horse blood agar) bezeichnet.[9] Columbia-Blutagar wird in den mikrobiologisch-infektiologischen Qualitätsstandards (MiQ) der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie (DGHM) als Nährmedium zur Erstisolierung bei zahlreichen klinischen Proben empfohlen.[10] Die mit dem Probematerial beimpften Nährmedien werden anschließend bei einer Temperatur von 35 ± 2 °C in einer mit Kohlenstoffdioxid (CO₂) angereicherten aeroben Atmosphäre inkubiert.[7]

Zahlreiche Mikroorganismen, die in der medizinischen Mikrobiologie als Krankheitserreger von Interesse sind, wachsen auf diesem Medium, beispielsweise Vertreter der Familie Enterobacteriaceae, Pseudomonas-Arten und weitere aerobe gramnegative Stäbchen. Bei den grampositiven Bakterien ist das Nährmedium u. a. für Streptokokken, Enterokokken, Staphylokokken und Corynebakterien geeignet. Weiterhin lassen sich Vertreter der Hefe-Gattung Candida damit kultivieren.[7]

Kochsalz-Blutagar ist mit 7,5 % Kochsalz versetzt. Er wird vor allem zur Anzucht von Staphylokokken verwendet, der Salzzusatz unterdrückt die Begleitflora.

Für die möglichst selektive Isolierung einiger Bakterien kann ein Blutagar mit Zusatz eines bestimmten Antibiotikums oder mehrerer Antibiotika eingesetzt werden, um die übrige Begleitflora zu hemmen.[11]

Eine Weiterentwicklung des Columbia-Blutagar stellt der CNA-Blutagar, oder auch kurz CNA-Agar dar.[12] Der Name des CNA-Agars verweist auf die zwei im Nährmedium enthaltenen Antibiotika Colistin (Polymyxin E) und Nalidixinsäure. Sie sind meist in einer Massenkonzentration von jeweils 10 mg/l enthalten, die weitere Zusammensetzung entspricht der des Columbia-Blutagars mit 5 % Schafblut.[12] Die beiden zusätzlich enthaltenen Wirkstoffe unterdrücken das Wachstum der gramnegativen Bakterien, so dass CNA-Agar als Selektivmedium zur Isolierung von grampositiven Bakterien (v. a. Streptokokken und Staphylokokken) aus zahlreichen klinischen und nicht-klinischen Proben verwendet wird.[12]

Hefen wie Candida werden nicht im Wachstum gehemmt und auch gramnegative Bakterien, die gegen die verwendeten Antibiotika resistent sind, können auf dem CNA-Agar wachsen. Es gibt leicht modifizierte Varianten, die neben einer geringeren Konzentration an Nalidixinsäure auch noch ein drittes Antibiotikum – Aztreonam – enthalten, das diese gramnegativen Bakterien hemmen soll.[13]

Ein weiteres Beispiel für einen Blutagar mit Zusatz eines Antibiotikums ist der Gentamicin-Blutagar (GBA), der auf dem Columbia-Blutagar basiert (mit 10 % Schafblut) und zusätzlich 5,5 mg/l Gentamicin enthält. Mit diesem Nährmedium gelingt die selektive Kultivierung von Streptococcus pneumoniae und anderen Streptokokken, außerdem von Spezies aus den Gattungen Bacteroides, Clostridium und verschiedener Hefen.[14][11]

Um Aeromonas-Arten selektiv aus menschlichen und tierischen Kotproben zu isolieren, wird der Zusatz von Ampicillin empfohlen. Untersuchungen von verschiedenen Selektivmedien für Aeromonas haben gezeigt, dass ein Columbia-Blutagar (mit 5 % Schafblut) mit einem Zusatz von 30 mg/l Ampicillin die höchste Wiederfindungsrate (98 %) erzielt. Ein derartiges Medium wird auch als ASBA 30 bezeichnet (Ampicillin-Schafblut-Agar mit 30 mg/l Ampicillin).[15]

Die American Public Health Association (die Gesundheitsbehörde in den USA) empfiehlt in ihren Richtlinien zur mikrobiologischen Untersuchung von Lebensmitteln unter anderem den Zusatz folgender Antibiotika: Ampicillin, Cycloheximid, Moxalactam, Novobiocin, Oxytetracyclin und Polymyxin B.[11]