Bisulfit-Sequenzierung

Die Bisulfit-Sequenzierung ist eine biochemische Methode zur Bestimmung von DNA-Methylierungen im Rahmen epigenetischer Untersuchungen durch Reaktion mit Bisulfit.[1][2] Die Bisulfit-Sequenzierung besteht aus einer Bisulfit-Konversion meistens in Kombination mit einer DNA-Sequenzierung.

Bisulfit-Konversion

Prinzip

DNA-Methylierungen kommen in der Epigenetik zur Inaktivierung von Genen vor. Bei Tieren betrifft die Methylierung vor allem Cytosine an der C5-Position in CpG-Dinukleotiden. Durch Behandlung von DNA mit Bisulfit werden durch die Bisulfit-Reaktion unmethylierte Cytosine zu Uracilen konvertiert, während 5-Methylcytosin nicht mit Bisulfit reagiert. Eine anschließende Amplifikation erfolgt meistens per Polymerase-Kettenreaktion (PCR), per methylation-specific PCR (MSP) oder per Microarray.[3][4][5][6] Probleme bei der Bisulfit-Sequenzierung sind die fehlende Unterscheidbarkeit zwischen Methylcytosin und dem in manchen Geweben auftretenden Hydroxymethylcytosin sowie eine unvollständige Bisulfitreaktion bei doppelsträngiger DNA und ein verstärkter Abbau von DNA durch Depurinierung.[7][8][9] Uracil wird in der PCR und DNA-Sequenzierung wie Thymin erkannt und der Gegenstrang aufgrund der Basenpaarung mit Adenin komplementär aufgefüllt, während in der Bisulfit-unbehandelten DNA-Sequenzierung Cytidine mit Guaninen gepaart werden. Daraus ergeben sich zwei DNA-Sequenzen (behandelt und unbehandelt), von denen die Bisulfit-Behandelte an den unmethylierten Stellen C->U-Transitionen aufweist und bei der in einer DNA-Sequenzierung dann mit A anstelle von G gepaart wird. Durch eine vorangehende Oxidation von Hydroxymethylcytosinen können Cytosine eindeutig bestimmt werden.[10]

PCR-basierte Analyseverfahren

PCR-basierte Analyseverfahren sind z. B. die DNA-Sequenzierung,[11][12] die Methylation-sensitive single-strand conformation analysis (MS-SSCA),[13] die High resolution melting analysis (HRM),[14] die Methylation-sensitive single-nucleotide primer extension (MS-SnuPE)[15][16] und die Base-specific cleavage/MALDI-TOF.[17][18]

Methylation-specific PCR-Varianten sind z. B. die MSP,[19] die methylierungssensitive qPCR MethyLight,[20][21] die melting curve analysis (Mc-MSP)[22][23] und Oligonukleotid-Microarrays.[24]

Alternative Methoden sind z. B. die Combined Bisulphite Restriction Analysis und die methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP).

Einzelnachweise
  1. Frommer M, McDonald LE, Millar DS, et al.: A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. In: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89. Jahrgang, Nr. 5, März 1992, S. 1827–31, doi:10.1073/pnas.89.5.1827, PMID 1542678, PMC 48546 (freier Volltext).
  2. Chatterjee A, Stockwell PA, Rodger EJ and Morison IM 2012. Comparison of alignment software for genome-wide bisulphite sequence data. Nucleic Acids Research 40(10): e79.
  3. Fraga MF, Esteller M: DNA methylation: a profile of methods and applications. In: BioTechniques. 33. Jahrgang, Nr. 3, September 2002, S. 632, 634, 636–49, PMID 12238773.
  4. Osman El-Maarri: Methods: DNA methylation. In: Peroxisomal Disorders and Regulation of Genes (= Advances in Experimental Medicine and Biology). Band 544, 2003, ISBN 978-0-306-48174-1, S. 197–204, doi:10.1007/978-1-4419-9072-3_23.
  5. Laird PW: The power and the promise of DNA methylation markers. In: Nat. Rev. Cancer. 3. Jahrgang, Nr. 4, April 2003, S. 253–66, doi:10.1038/nrc1045, PMID 12671664.
  6. Callinan PA, Feinberg AP: The emerging science of epigenomics. In: Hum Mol Genet. 15. Jahrgang, Nr. 90001, 2006, S. R95–101, doi:10.1093/hmg/ddl095.
  7. Huang Y, Pastor WA, Shen Y, Tahiliani M, Liu DR, Rao A. The Behaviour of 5-Hydroxymethylcytosine in Bisulfite Sequencing. PloS one.2010;5(1):e8888.
  8. Grunau C, Clark SJ, Rosenthal A: Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters. In: Nucleic Acids Res. 29. Jahrgang, Nr. 13, Juli 2001, S. E65–5, doi:10.1093/nar/29.13.e65, PMID 11433041, PMC 55789 (freier Volltext).
  9. Ehrich M, Zoll S, Sur S, van den Boom D: A new method for accurate assessment of DNA quality after bisulfite treatment. In: Nucleic Acids Res. 35. Jahrgang, Nr. 5, 2007, S. 29, doi:10.1093/nar/gkl1134, PMID 17259213, PMC 1865059 (freier Volltext).
  10. M. J. Booth, M. R. Branco, G. Ficz, D. Oxley, F. Krueger, W. Reik, S. Balasubramanian: Quantitative sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at single-base resolution. In: Science. Band 336, Nummer 6083, Mai 2012, S. 934–937, ISSN 1095-9203. doi:10.1126/science.1220671. PMID 22539555.
  11. Colella S, Shen L, Baggerly KA, Issa JP, Krahe R: Sensitive and quantitative universal Pyrosequencing methylation analysis of CpG sites. In: BioTechniques. 35. Jahrgang, Nr. 1, Juli 2003, S. 146–50, PMID 12866414.
  12. Tost J, Dunker J, Gut IG: Analysis and quantification of multiple methylation variable positions in CpG islands by Pyrosequencing. In: BioTechniques. 35. Jahrgang, Nr. 1, Juli 2003, S. 152–6, PMID 12866415.
  13. Bianco T, Hussey D, Dobrovic A: Methylation-sensitive, single-strand conformation analysis (MS-SSCA): A rapid method to screen for and analyze methylation. In: Hum. Mutat. 14. Jahrgang, Nr. 4, 1999, S. 289–93, doi:10.1002/(SICI)1098-1004(199910)14:4<289::AID-HUMU3>3.0.CO;2-A, PMID 10502775.
  14. Wojdacz TK, Dobrovic A: Methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM): a new approach for sensitive and high-throughput assessment of methylation. In: Nucleic Acids Res. 35. Jahrgang, Nr. 6, 2007, S. e41, doi:10.1093/nar/gkm013, PMID 17289753, PMC 1874596 (freier Volltext).
  15. Gonzalgo ML, Jones PA: Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE). In: Nucleic Acids Res. 25. Jahrgang, Nr. 12, Juni 1997, S. 2529–31, doi:10.1093/nar/25.12.2529, PMID 9171109, PMC 146734 (freier Volltext).
  16. Uhlmann K, Brinckmann A, Toliat MR, Ritter H, Nürnberg P: Evaluation of a potential epigenetic biomarker by quantitative methyl-single nucleotide polymorphism analysis. In: Electrophoresis. 23. Jahrgang, Nr. 24, Dezember 2002, S. 4072–9, doi:10.1002/elps.200290023, PMID 12481262.
  17. Ehrich M, Nelson MR, Stanssens P, et al.: Quantitative high-throughput analysis of DNA methylation patterns by base-specific cleavage and mass spectrometry. In: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102. Jahrgang, Nr. 44, November 2005, S. 15785–90, doi:10.1073/pnas.0507816102, PMID 16243968, PMC 1276092 (freier Volltext).
  18. Frommer M, McDonald LE, Millar DS, et al. (March 1992). "A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (5): 1827–31. doi:10.1073/pnas.89.5.1827. PMC 48546 (freier Volltext). PMID 1542678.
  19. Herman JG, Graff JR, Myöhänen S, Nelkin BD, Baylin SB: Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. In: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93. Jahrgang, Nr. 18, September 1996, S. 9821–6, doi:10.1073/pnas.93.18.9821, PMID 8790415, PMC 38513 (freier Volltext).
  20. Eads CA, Danenberg KD, Kawakami K, et al.: MethyLight: a high-throughput assay to measure DNA methylation. In: Nucleic Acids Res. 28. Jahrgang, Nr. 8, April 2000, S. E32, doi:10.1093/nar/28.8.e32, PMID 10734209, PMC 102836 (freier Volltext).
  21. Rand K, Qu W, Ho T, Clark SJ, Molloy P: Conversion-specific detection of DNA methylation using real-time polymerase chain reaction (ConLight-MSP) to avoid false positives. In: Methods. 27. Jahrgang, Nr. 2, Juni 2002, S. 114–20, doi:10.1016/S1046-2023(02)00062-2, PMID 12095268 (elsevier.com).
  22. Akey DT, Akey JM, Zhang K, Jin L: Assaying DNA methylation based on high-throughput melting curve approaches. In: Genomics. 80. Jahrgang, Nr. 4, Oktober 2002, S. 376–84, doi:10.1006/geno.2002.6851, PMID 12376091 (elsevier.com).
  23. Kristensen LS, Mikeska T, Krypuy M, Dobrovic A: Sensitive Melting Analysis after Real Time - Methylation Specific PCR (SMART-MSP): high-throughput and probe-free quantitative DNA methylation detection. In: Nucleic Acids Res. 36. Jahrgang, Nr. 7, April 2008, S. e42, doi:10.1093/nar/gkn113, PMID 18344521, PMC 2367707 (freier Volltext).
  24. Adorján P, Distler J, Lipscher E, et al.: Tumour class prediction and discovery by microarray-based DNA methylation analysis. In: Nucleic Acids Res. 30. Jahrgang, Nr. 5, März 2002, S. e21, doi:10.1093/nar/30.5.e21, PMID 11861926, PMC 101257 (freier Volltext).
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