Auflösung (Mikroskopie)

Mikroskopische Aufnahme eines Gitters mit 600 Linien pro Millimeter, das für Beugungsversuche verwendet werden kann.

Beugung eines Laserstrahls (von links kommend) an einem Strichgitter. Es handelt sich um ein Beispiel einer zentralen Beleuchtung, da das Gitter nicht (auch) von schräg einfallendem Licht beleuchtet wird. Ein Objektiv könnte vom Gitter nur dann ein Bild mit Strukturinformation erzeugen, wenn außer dem Hauptmaximum (gerade Fortsetzung des Laserstrahls) noch mindestens das erste Nebenmaximum (Strahlen im 20°-Winkel) aufgefangen wird.

Der halbe Öffnungswinkel α eines Objektivs. Hier beträgt der Wert etwa α = 50°. Für ein Trockenobjektiv ergibt das eine numerische Apertur von sin 50° = 0,77.

Ernst Abbe untersuchte das Beugungsverhalten des Lichts an Strichgittern. Je dichter die Striche des (optischen) Gitters beieinander liegen (also je mehr Linien auf einen Millimeter kommen), desto stärker wird hindurch tretendes Licht gebeugt. Es wird zunächst der Fall betrachtet, dass das Licht (nur) senkrecht auf die Rückseite des Gitters auftrifft (zentrale Beleuchtung). Um Informationen über die abzubildende Gitterstruktur zu erhalten, muss außer dem gerade (senkrecht) durch das Gitter hindurch tretenden Hauptmaximum des Beugungsmusters auch mindestens das erste Nebenmaximum aufgefangen werden. Die Öffnung (genauer: der Öffnungswinkel) des Objektivs muss hierfür ausreichend groß sein. Liegen die Striche des Gitters so dicht beieinander, dass das erste Nebenmaximum nicht mehr vom Objektiv aufgefangen werden kann, wird die Gitterstruktur demnach nicht mehr aufgelöst.[2]

Abbe schrieb über diese Zusammenhänge 1873 in seinem Werk „Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung“[3]:

und an anderer Stelle genauer:

„Schiefe Beleuchtung“ meint hier eine Beleuchtung mit Kondensor, der bewirkt, dass das Licht als Strahlkegel auf das Präparat auftrifft und nicht als Zylinder wie bei zentraler Beleuchtung. Eine korrekte Beleuchtung, die auch schräg einfallendes Licht einschließt, ist zum Erreichen der maximal möglichen Auflösung wesentlich. Außerdem zeigt sich die Bedeutung der Wellenlänge: Da kurzwelliges (blaues) Licht weniger stark gebeugt wird als langwelliges (rotes), kann mit kurzwelligem Licht eine bessere Auflösung erreicht werden. Das Abbe-Kriterium ist absolut, es kann mit klassischer Mikroskopie nicht überwunden werden.[4]

Die abbeschen Überlegungen zur Bildentstehung gelten für Fälle, in denen einfallendes Licht vom Präparat gebeugt wird und dann weiter zum Detektor geleitet wird. Da die Beleuchtung von einer Lichtquelle kommt, kann sie als kohärent angesehen werden. Für selbstleuchtende Objekte machen Abbes Überlegungen keine Aussagen. Auch für die Auflösung entlang der optischen Achse (z-Richtung) wird keine Angabe gemacht.[5]

Für alle Formeln gilt: ${\displaystyle d}$ ist die erzielbare Auflösung, genauer: der Abstand, den zwei Linien in einem Gitter mindestens haben müssen, damit sie im Mikroskop noch als getrennte Linien erkannt werden können.

Für den Fall einer ausschließlich zentralen Beleuchtung ohne Kondensor ergibt sich

${\displaystyle d={\frac {\lambda }{n\sin \alpha }}}$

oder, da ${\displaystyle n\cdot \sin \alpha }$ die numerische Apertur (NA) ist,

${\displaystyle d={\frac {\lambda }{\mathrm {NA_{Objektiv}} }}}$.

mit λ der Wellenlänge des verwendeten Lichts, n dem Brechungsindex des Immersionsmediums und α dem halben Öffnungswinkel des Objektivs.

Abbe-Denkmal in Jena mit der Auflösungsformel im oberen Bereich.

Die von Abbe erwähnte „äußerste schiefe Beleuchtung“ bezeichnet einen Durchlicht-Strahlengang, bei dem zur Beleuchtung ein Kondensor eingesetzt wird, der mindestens den gleichen Öffnungswinkel beziehungsweise mindestens die gleiche numerische Apertur hat wie das Objektiv. Für diesen Fall ergibt sich die Abbe’sche Formel in ihrer wohl bekanntesten Form:

${\displaystyle d={\frac {\lambda }{2n\sin \alpha }}}$

oder, wegen ${\displaystyle n\cdot \sin \alpha =\mathrm {NA} }$ verkürzt

${\displaystyle d={\frac {\lambda }{2\mathrm {NA} }}}$

Wenn die numerische Apertur von Kondensor und Objektiv gleich groß sind ergibt sich ein praktisches Problem: Der Bildkontrast ist sehr niedrig. Ein optimaler Bildkontrast stellt sich ein, wenn die numerische Apertur des Kondensors bei 2/3 der numerischen Apertur des Objektivs liegt. Gegebenenfalls kann die Kondensorblende (= Aperturblende) zugezogen werden, um dies zu erreichen. Unter der Bedingung, dass die Kondensorapertur kleiner ist als die Objektivapertur gilt folgende Formel:[5]

${\displaystyle d={\frac {\lambda }{\mathrm {NA_{Objektiv}} +\mathrm {NA_{Kondensor}} }}}$

Diese Fassung kann auch als allgemeine Form angesehen werden, da bei zentraler Beleuchtung gilt ${\displaystyle \mathrm {NA_{Kondensor}} =0}$ und sich bei gleich großen Aperturen wiederum 2NA unter dem Bruchstrich ergibt.

• Objektiv mit NA 0,25 (bei vielen 10x-Objektiven); Kondensor mit NA 0,55, gelb-grünes Licht mit 550 nm, da das Auge für diesen Farbbereich am empfindlichsten ist.

${\displaystyle d={\frac {550\,{\text{nm}}}{2\cdot 0{,}25}}=1100\,{\text{nm}}}$

Die Kondensorapertur kann maximal mit dem gleichen Wert eingehen wie die Objektivapertur, daher wird im Fall einer größeren Kondensorapertur die Objektivapertur mal zwei genommen.

• Objektiv mit NA 0,65 (bei vielen 40x-Objektiven); Kondensor mit 0,55, Licht mit 550 nm.

${\displaystyle d={\frac {550\,{\text{nm}}}{0{,}65+0{,}55}}=450\,{\text{nm}}}$

• Ölimmersionsobjektiv mit NA 1,4 und Ölimmersionskondensor mit 1,4, Licht mit 550 nm

${\displaystyle d={\frac {550\,{\text{nm}}}{1{,}4+1{,}4}}=196\,{\text{nm}}}$

Für die Auflösung selbstleuchtender Strukturen, wie sie unter anderem in der Fluoreszenzmikroskopie auftreten, gelten die hier aufgeführten Gesetzmäßigkeiten. Die Erstbeschreibung dieser Regeln für die Mikroskopie wird je nach Lehrbuch entweder[4] auf eine Arbeit von 1896[6] von John William Strutt, 3. Baron Rayleigh, zurückgeführt, oder auf Rayleigh und Hermann von Helmholtz[7][8] oder nur auf Arbeiten von Helmholtz[9][10] von 1873 oder 1874. In allen Fällen wird das entsprechende Kriterium als Rayleigh-Kriterium bezeichnet, das aus der Astronomie bzw. vom Teleskop auf das Mikroskop übertragen wurde.

Mikroskopische Bilder selbstleuchtender Punkte sind keine Punkte, sondern Beugungsmuster, deren Helligkeitsverteilung von der Punktspreizfunktion abhängt. Diejenige Ebene des Musters, welche die höchste Intensität enthält (Schärfeebene), wird als Beugungsscheibchen bezeichnet. Das Rayleigh-Kriterium besagt, dass sich zwei selbstleuchtende Punkte, die nebeneinander in der Schärfeebene liegen, dann gerade noch unterscheiden lassen, wenn das Intensitätsmaximum des Beugungsscheibchens des ersten Punktes in das Minimum des Beugungsscheibchens des zweiten Punktes fällt (siehe Abbildung). Die Helligkeit der dunkelsten Stelle zwischen den beiden Maxima beträgt dann 73,5 % der Maxima. Beim Rayleigh-Kriterium handelt es sich also um eine Konvention und nicht um ein absolutes Kriterium, da manche Beobachter vielleicht auch noch Beugungsscheibchen unterscheiden können, die noch dichter zusammen liegen.[4][11]

Die in diesem Abschnitt aufgeführten Formeln gelten für selbstleuchtende Punkte bei Beobachtung mit klassischer Mikroskopie, beispielsweise in der klassischen Fluoreszenzmikroskopie. Für konfokale Mikroskopie und Multiphotonen-Anregung siehe die entsprechenden Abschnitte.

Auch beim Rayleigh-Kriterium geht die Wellenlänge ein, jedoch nicht wie beim Abbe-Limit die von am Objekt gebeugten Licht, sondern die Wellenlänge des vom Objekt abgestrahlten Lichts, bei Fluoreszenzmikroskopie also die Wellenlänge der Fluoreszenz.[2]

Die Auflösung (Rayleigh-Kriterium) in der Fokusebene beträgt

${\displaystyle d={\frac {0{,}61\lambda }{\mathrm {NA} }}}$ ,   manchmal auch angegeben in der Form  ${\displaystyle d={\frac {1{,}22\lambda }{2\mathrm {NA} }}}$ ,

wobei NA die numerische Apertur des verwendeten Objektivs ist und λ die Wellenlänge des emittierten Lichtes.[12]

Die Auflösung eines Mikroskops ist entlang der optischen Achse (z-Richtung) generell schlechter als innerhalb der Fokusebene. Für selbstleuchtende Punkte (klassische Fluoreszenzmikroskopie) kann wie beim Rayleigh-Kriterium auch entlang der optischen Achse der Abstand berechnet werden, der zwischen dem Helligkeitsmaximum des Beugungsmusters und dem ersten Minimum entlang der optischen Achse liegt. Auf Grund der zugrunde liegenden theoretischen Annahmen gilt die sich ergebende Formel aber nur für paraxiale Optik, also für Objektive mit kleinen Öffnungswinkeln und niedriger numerischer Apertur.[13]

${\displaystyle d={\frac {2\lambda n}{\mathrm {NA} ^{2}}}}$

wobei ${\displaystyle n}$ der Brechungsindex des Mediums zwischen Objektiv und Deckglas oder Präparat ist, also zum Beispiel 1 für Luft bei Trockenobjektiven oder 1,518 für typisches Immersionsöl. Eine Bestimmung der Intensitätsverteilung für Objektive mit höherer numerischer Apertur kann unter Anwendung der Fresnel-Huygens-Theorie erreicht werden, wobei weniger Annahmen erforderlich sind und somit eine realistischere Verteilung resultiert.[13]

Während die laterale Auflösung bei Objektiven mit gleicher numerischen Apertur immer gleich ist, ergibt sich aus dieser Formel, dass Immersionsobjektive in axialer Richtung bei gleicher numerischen Apertur eine schlechtere Auflösung haben, da der Brechungsindex n des Immersionsmediums hier auch über dem Bruchstrich eingeht. Da Immersionsobjektive jedoch meistens eine höhere numerische Apertur haben als Trockenobjektive, kommt dieser Aspekt selten zum Tragen, da eine höhere numerische Apertur im Quadrat zu einer Verbesserung der Auflösung beiträgt.[13]

Die Auflösung nach dem Rayleigh-Kriterium lässt sich zwar berechnen, aber experimentell nur schwer bestimmen: Zwei sehr kleine Objekte müssten immer näher zusammengeschoben werden, bis sie nicht mehr unterscheidbar wären. Aus praktischen Gründen behilft man sich in der Fluoreszenzmikroskopie daher mit der Halbwertsbreite (englisch full width half maximum, FWHM) der Punktspreizfunktion (englisch point spread function, PSF). Die Punktspreizfunktion beschreibt das durch Beugung zu Stande kommende dreidimensionale Abbild eines fluoreszenten Punktes, sie ist eine Funktion des optischen Systems, im Wesentlichen des Objektivs. Sie kann ebenfalls berechnet werden.[14] Für die experimentelle Bestimmung werden fluoreszierende Objekte eingesetzt, deren Größe unter der Auflösungsgrenze liegt, beispielsweise 150 Nanometer kleine, mit Fluoreszenzfarbstoff getränkte Latexkügelchen oder Quantenpunkte. Gemessen wird die Halbwertsbreite der Intensitätskurve in Nanometern oder Mikrometern (siehe Abbildung). Auflösung und Halbwertsbreite der PSF stehen in einer mathematischen Beziehung zueinander, die PSF-Halbwertsbreite liegt bei etwas kleineren Werten als die Auflösung.[15]

Die in diesem Abschnitt aufgeführten Formeln gelten für selbstleuchtende Punkte bei Beobachtung mit klassischer Mikroskopie, beispielsweise in der klassischen Fluoreszenzmikroskopie. Für konfokale Mikroskopie und Multiphotonen-Anregung siehe die entsprechenden Abschnitte.

In x,y-Richtung liegt die Halbwertsbreite der PSF bei

${\displaystyle \mathrm {FWHM} _{\text{(x,y)}}={\frac {0{,}51\lambda }{\mathrm {NA} }}}$

wobei NA die numerische Apertur des verwendeten Objektivs ist und λ die Wellenlänge des emittierten Lichtes.[12]

Entlang der optischen Achse (z-Richtung) liegt die Halbwertsbreite der PSF bei

${\displaystyle \mathrm {FWHM} _{z}={\frac {0{,}88\lambda }{n-{\sqrt {n^{2}-\mathrm {NA} ^{2}}}}}}$.[12]

Diese Formel kann bei numerischen Aperturen unter 0,5 verkürzt werden auf

${\displaystyle \mathrm {FWHM} _{z}={\frac {1{,}77n\lambda }{\mathrm {NA} ^{2}}}}$.[12]

Für ein Ölimmersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von 1,4 und bei einer Wellenlänge von 550 nm ergibt sich in der Fokusebene (x,y) eine Halbwertsbreite von

${\displaystyle \mathrm {FWHM} _{\text{(x,y)}}={\frac {0{,}51\cdot 550\,{\text{nm}}}{1{,}4}}=200\,{\text{nm}}}$

Entlang der optischen Achse bei Verwendung eines Immersionsöls mit dem Brechungsindex n=1,518 ergibt sich

${\displaystyle \mathrm {FWHM} _{z}={\frac {0{,}88\cdot 550\,{\text{nm}}}{1{,}518-{\sqrt {1{,}518^{2}-1{,}4^{2}}}}}=520\,{\text{nm}}}$

Der Ansatz der Verkleinerung der Wellenlänge führte Anfang des 20. Jahrhunderts zur Entwicklung der UV-Mikroskopie, bei der UV-Licht statt sichtbarem Licht eingesetzt wurde. August Köhler entwickelte entsprechende Geräte ab 1900 bei Zeiss. Damit ließ sich die Auflösung bei einer verglichen mit sichtbarem Licht halbierter Wellenlänge auf das Doppelte steigern. Da das menschliche Auge dieses Licht nicht wahrnehmen kann, ist eine Darstellung nur mittels Film oder Fluoreszenzschirmen möglich. Außerdem müssen Linsen, Objektträger und so weiter aus Quarzglas, Flussspat oder Lithiumfluorid hergestellt werden, da normales Glas UV-Licht absorbiert. Auf Grund dieser Schwierigkeiten konnte sich die UV-Mikroskopie nicht generell durchsetzen und blieb Spezialanwendungen vorbehalten.[16][17][18]

Als Nebeneffekt der Versuche von Köhler wurde die Möglichkeit der Fluoreszenzmikroskopie entdeckt, da einige untersuchte Stoffe bei Anregung mit UV-Licht fluoreszierten.[18]

Die numerische Apertur NA ist das Produkt aus n, dem Brechungsindex des Mediums zwischen Präparat und Objektiv, und sinα, dem Sinus des halben Öffnungswinkels. Um NA zu vergrößern muss also einer der beiden Faktoren vergrößert werden. Angenommen ein Objektiv hätte eine unendlich große Frontlinse, dann wäre der Öffnungswinkel 180°, der halbe Öffnungswinkel demnach 90° und dessen Sinus also 1. Da die Frontlinse des Objektivs aber endlich groß ist und auch ein gewisser Arbeitsabstand zwischen Schärfeebene und Frontlinse erforderlich ist, ist sinα immer kleiner als 1. Hochwertige Objektive können Werte von 0.95 erreichen.[18]

Der Brechungsindex kann gesteigert werden, indem Immersion eingesetzt wird, also eine Flüssigkeit zwischen Präparat und Objektiv eingebracht wird. Hierfür sind für verschiedene Immersionsmedien jeweils spezielle Objektive notwendig, deren Linsen so berechnet wurden, dass sie dem veränderten Brechungsverhalten vor dem Objektiv angepasst sind. Während Luft einen Brechungsindex von etwa 1 hat, liegt der von Wasser bei 1,33 und der von typischem Immersionsöl bei 1,518. Entsprechend kann die Auflösung mit Ölimmersion um über 50 % gegenüber immersionsfreier Mikroskopie gesteigert werden.

Die höchsten numerischen Aperturen mit weiterer Verbreitung liegen daher bei NA=1,4 für Ölimmersionsobjektive mit einer Vergrößerung von 100× oder 60×. Auch Ölimmersionskondensoren können NA=1,4 erreichen. Einen noch höheren Brechungsindex als Öl hat Monobromnaphthalin mit n=1,666, das Ernst Abbe in die Mikroskopie einführte. Entsprechende Objektive erreichten eine NA von 1,63. Sie waren jedoch nicht für die Durchlichtmikroskopie biologischer Objekte geeignet, da zu ihrer Verwendung auch Objektträger, Deckgläser, Einbettmedium sowie das eigentliche Objekt einen mindestens gleich hohen Brechungsindex hätten aufweisen müssen.[16][19][18]

Höhere numerische Aperturen als 1,4 finden sich heute mit 1,45 bei speziellen Ölimmersionsobjektiven für die TIRF-Mikroskopie.

Durch die PSF-Multiplikation ändert sich der Durchmesser des Beugungsscheibchens nicht, das erste Minimum ist noch an der gleichen Stelle wie zuvor. Allerdings ist der Helligkeitsanstieg nun steiler, die Flanken der Helligkeitsverteilung rücken nach innen. Zwei solcher multiplizierten Beugungsscheibchen liegen daher dichter beieinander, wenn die minimale Intensität zwischen den Maxima die oben beim Rayleigh-Kriterium erwähnten 73,5 % erreicht, man spricht dann vom verallgemeinerten Rayleigh-Kriterium[20]. Theoretisch ergibt sich dadurch eine Verbesserung der Auflösung um den Faktor ${\displaystyle {\tfrac {1}{\sqrt {2}}}}$, also etwa ${\displaystyle {\tfrac {1}{1{,}4}}}$.[11][21]

In der Fokusebene ergäbe sich für die Halbwertsbreite des Signals eines fluoreszierenden punktförmigen Objekts ${\displaystyle {\tfrac {0{,}51\lambda }{{\sqrt {2}}\cdot \mathrm {NA} }}}$ oder ${\displaystyle {\tfrac {0{,}37\lambda }{\mathrm {NA} }}}$, wobei bei Fluoreszenz als Wellenlänge der Mittelwert von Anregungs- und Emissionswellenlänge einzusetzen ist. Bei grünem Licht (Wellenlänge 500 nm) entspricht dies bei einem Ölimmersionsobjektiv mit 1,4 numerischer Apertur einer Halbwertsbreite von 132 nm (nicht-konfokal: 182 nm). Jedoch kann dieser Wert nur theoretisch, bei unendlich kleiner Lochblende erreicht werden, bei der also kein Licht mehr aufgefangen werden würde. Auch wird vorausgesetzt, dass das anregende Licht das Objektiv von der Rückseite her vollständig ausfüllt. Dies ist jedoch nicht immer der Fall.[21][12]

Die praktisch erzielbare Verbesserung ist daher geringer. Sie hängt davon ab, wie viel des Beugungsscheibchens von der Lochblendenöffnung durchgelassen wird, also vom Durchmesser der Lochblende. Liegt der Lochblendendurchmesser im ersten Minimum des Beugungsscheibchens, so ist die Auflösung in der Fokusebene nicht mehr besser als im nicht-konfokalen Fall, wogegen die Signalintensität dann schon fast maximal ist. Der Ausschluss von Fluoreszenz aus anderen Ebenen funktioniert jedoch noch recht gut.[20] Daher ist dieser Wert bei kommerziellen Konfokalmikroskopen häufig voreingestellt. Er wird als eine Airy unit (AU) bezeichnet, nach den englischen Begriffen Airy disk (= Beugungsscheibchen) und unit (= Maßeinheit).[12]

Auch hier gibt sich wie in der Fokusebene theoretisch eine Verbesserung um den Faktor ${\displaystyle {\frac {1}{\sqrt {2}}}}$, also für die Halbwertsbreite der PSF eines fluoreszierenden Punktobjekts   ${\displaystyle {\frac {0{,}64\lambda }{n-{\sqrt {n^{2}-\mathrm {NA} ^{2}}}}}}$

Die Wellenlänge ist wiederum der Mittelwert von Anregungslicht und Fluoreszenzlicht.

Eine dünne fluoreszierende Schicht hat für die Halbwertsbreite eine ähnliche, aber etwas andere Gleichung:

${\displaystyle {\frac {0{,}67\lambda }{n-{\sqrt {n^{2}-\mathrm {NA} ^{2}}}}}}$.[12]

Es ergeben sich für diese theoretische Auflösungsverbesserung die gleichen praktischen Einschränkungen, die im vorigen Abschnitt schon für die Auflösungsverbesserung in der Fokusebene beschrieben wurden.[12]