Xel d'agarosa tiñíu con bromuru de etidio qu'amuesa dellos productos de PCR llograos por aciu l'usu de distintos cebadores, que presenten un baxu nivel d'especificidá.

La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR poles sos sigles n'inglés (polymerase chain reaction), ye una téunica de bioloxía molecular desenvuelta en 1983 por Kary Mullis.[1]El so oxetivu ye llograr un gran númberu de copies d'un fragmentu d'ADN particular, partiendo d'un mínimu; en teoría basta partir d'una única copia d'esi fragmentu orixinal, o molde.[2]

Esta téunica sirve p'amplificar un fragmentu d'ADN; la so utilidá ye que tres l'amplificación resulta muncho más fácil identificar con una bien alta probabilidá, virus o bacteries causantes d'una enfermedá, identificar persones (cadabres) o faer investigación científica sobre l'ADN amplificáu. Estos usos derivaos de l'amplificación fixeron que se convierta nuna téunica bien estendida, sobremanera nel ámbitu de la investigación forense, col consiguiente abaratamientu del equipu necesariu pa llevar a cabu dicha téunica.

Fundamentu ya importancia

Esta téunica encontar na propiedá natural de los ADN polimerasas pa retrucar hebras d'ADN, pa lo cual empléguense ciclos d'altes y baxes temperatures alternaes pa dixebrar les hebras d'ADN recién formaes ente sigo tres cada fase de replicación y, de siguío, dexar que les hebras d'ADN vuelvan xunise pa poder doblales nuevamente. La reacción en cadena de la polimerasa foi perfeccionada por Kary Mullis perteneciente a la Cetus Corporation en California, na década de 1980. Primeramente la téunica yera lenta, una y bones les polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambeos de temperatura y yera necesariu amestar nueves polimerasas en cada ciclu. Yá que les temperatures del ciclu (95 °C nes fases de desnaturalización del ADN) suponen la inmediata desnaturalización de toa proteína, empléguense ADN polimerasas termoestables, estrayíes de microorganismos afechos a vivir a eses temperatures, restrictives pa la mayoría de los seres vivos. Dichos microorganismos, xeneralmente arquies, son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus thermophilus (Tth). Xeneralmente empléguense amiestos de polimerasas bien procesivas (Taq) con otres capaces de faer correición d'errores (Pfu, Vent).

Termociclador: aparatu nel que s'efectúa la PCR convencional.

Güei, tol procesu de la PCR ta automatizado por aciu un aparatu llamáu termociclador, que dexa calecer y esfrecer los tubos de reacción pa controlar la temperatura necesario pa cada etapa de la reacción. Munchos termocicladores modernos faen usu del efeutu Peltier, que dexa tanto calecer como esfrecer los tubos a cencielles invirtiendo la corriente llétrica. Los tubos usaos pa PCR tienen una paré bien fina, lo que favorez una bona conductividá térmica, dexando que s'algame rápido'l equilibriu térmicu. Casi tolos termocicladores tienen un sistema que calez la tapa de zarru col fin d'evitar la condensación sobre los tubos de reacción. Los termocicladores más antiguos escarecíen d'esti sistema y solucionaben el problema de la condensación con una capa d'aceite na parte cimera del amiestu de reacción o con un pocu de cera dientro de los tubos. Anguaño esisten dellos termocicladores qu'utilicen o pueden utilizar aceite mineral nel tubu de PCR como los termocicladores de nueva xeneración de fluxu de aíre.

Polo xeneral, la PCR ye una téunica común y de normal indispensable en llaboratorios d'investigación médica y biolóxica pa una gran variedá d'aplicaciones. Ente elles inclúyense la clonación d'ADN pa la secuenciación, la filoxenia basada n'ADN, l'analís funcional de xenes, el diagnósticu de trestornos hereditarios, la identificación de buelgues xenétiques (usada en téuniques forenses y test de paternidá) y la detección y diagnósticu d'enfermedaes infeicioses.

Reactivos

Tubos de PCR qu'alluguen l'amiestu nun volume total de 100 μL.

Pa realizar la téunica precísense:[3]

  • Los 4 desoxirribonucleótidos-trifosfato (dNTP), sustratos para polimerizar nuevu ADN.
  • Dos cebadores o iniciadores (n'inglés, primers), oligonucleótidos que son, cada unu, complementarios a una de los dos hebras del ADN. Son secuencies curties, d'ente seis y cuarenta nucleótidos, de normal de dieciocho a ventidós, que dexen que la polimerasa empecipie la reacción. Tienen De tar engarraos y non a muncha distancia. Delimitan la zona d'ADN a amplificar, esto ye, correspuenden a los nucleótidos que definen los estremos de la secuencia que se desea retrucar.
  • Iones divalentes. Suelse usar magnesiu (Mg2+), amestáu comúnmente como cloruru de magnesiu (MgCl2), o dalgún otru catión divalente. Tamién puede emplegase manganesu (Mn2+), para mutagénesis d'ADN por aciu PCR, yá que altes concentraciones de Mn2+ amonten la tasa d'error mientres la síntesis d'ADN. Actúen como cofactores de la polimerasa.
  • Iones monovalentes, como'l potasiu.
  • Una solución tampón o buffer que caltién el pH fayadizu pal funcionamientu de l'ADN polimerasa.
  • ADN polimerasa o amiestu de distintes polimerasas con temperatura óptima alredor de 70 °C (la más común ye la polimerasa Taq).
  • ADN molde, que contién la rexón d'ADN que se va a amplificar.
  • Termociclador, l'aparatu que caltién la temperatura necesario en caúna de les etapes que conformen un ciclu.

Conceutos de la PCR

  • Sensibilidá: referir a la cantidá mínima d'ADN necesaria por que se produza l'amplificación, esto ye, pa llograr una banda. Rellacionar colos falsos negativos, yá que pue que una muestra sía positiva pero sía dada como negativa porque nun s'amplificó por non tener abonda cantidá d'ADN.
  • Especificidá: referir al llogru d'un solu productu amplificáu. Vien determinada polos oligos y l'especificidá cola que se xunen al ADN molde. D'esta forma, si los oligos tienen más d'un sitiu al que pueden xunise va apaecer más d'un productu amplificáu. Rellacionar colos falsos positivos, yá que pue que una muestra sía negativa pero sía dada como positiva porque s'amplificó una rexón d'ADN non diana o que nun se buscaba amplificar.
  • Eficiencia: referir a l'amplificación máxima que puede llograse nun númberu determináu de ciclos.
  • Fidelidá: referir a los errores que comete l'ADN polimerasa mientres l'amplificación. Esti conceutu ye d'especial importancia na secuenciación, pero n'otros casos nun ye tan importante. Una bona fidelidá dexa evitar falsos positivos y/o negativos.

Ciclu d'amplificación

Esquema xeneral de la PCR.
Grau d'amplificación según el númberu de ciclos emplegaos. A: xel de agarosa (1: ladder, 2: productu específicu, 3: productu inespecíficu); B concentración d'ADN respeuto del tiempu; C llogaritmu de la concentración d'ADN respeuto del tiempu.

El procesu de PCR polo xeneral consiste nuna serie de 20 a 35 cambeos repitíos de temperatura llamaos ciclos; cada ciclu suel consistir en 2-3 pasos a distintes temperatures. La PCR común realizar con ciclos que tienen tres pasos de temperatura. Los pasos de ciclos de cutiu tán precedíos por un choque térmicu (llamáu "hold") a alta temperatura (> 90 °C), y siguíu por otru hold a la fin del procesu pa la estensión de productu final o'l curtiu almacenaxe. Les temperatures usaes y el tiempu aplicáu en cada ciclu dependen de gran variedá de parámetros. Estos inclúin la enzima usada pa la síntesis d'ADN, la concentración d'iones divalentes y de los dNTP na reacción, y la temperatura d'unión de los cebadores, según el llargor del ADN que se desea amplificar.[3]

Anguaño, casi tolos termocicladores dan la opción de realizar la reacción de PCR cola llamada " tapa caliente". Esto ye, que'l sistema del termociclador va aplicar calor a la parte de riba del vial que contién l'amiestu de PCR. Al empiezu, los llaboratorios qu'empezaron a usar los primeros aparatos que se comercializaron y que nun incluyíen esti sistema teníen que poner unes gotes d'aceite dientro del vial. L'oxetivu d'esti procedimientu, al igual que'l de la tapa caliente, ye evitar la condensación de la muestra, yá que nel eppendorf atópense dos fases:líquidu y gas. Al entestase la muestra, perdemos volume del amiestu. Sicasí, caleciendo la tapa o poniendo les gotes d'aceite evitamos esti procesu físicu, calteniendo casi intactu'l volume de la muestra.

Entamu

Esti pasu consiste en llevar la reacción hasta una temperatura de 94-96 °C (ó 98 °C si ta usándose una polimerasa termoestable estrema), que se caltién mientres 1-9 minutos. Esto namái ye necesariu para ADN polimerasas que rican activación por calor.

Desnaturalización

De primeres, se desnaturaliza l'ADN (dixébrense los dos cadenes de les cualos ta constituyíu). Esti pasu puede realizase de distintes maneres, siendo'l calentamientu (94-95 °C) de la muestra la forma más habitual. La temperatura a la cual decide realizase la desnaturalización depende, por casu, de la proporción de G+C que tenga la cadena, como tamién de la llongura de la mesma. Otros métodos, raramente emplegaos na téunica de la PCR, seríen la adición de sales o axentes químicos capaces de realizar la desnaturalización.

Alliniadura o unión del cebador

De siguío va producise la hibridación del cebador, esto ye, el cebador va xunir a la so secuencia complementaria nel ADN molde. Pa ello ye necesariu baxar la temperatura a 40-68 °C mientres 20-40 segundos (según el casu), dexando asina l'alliniadura. Los puente d'hidróxenu estables ente les cadenes d'ADN (unión ADN-ADN) namái se formen cuando la secuencia del cebador ye bien similar a la secuencia del ADN molde. La polimerasa xune l'híbridu de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los cebadores van actuar como llendes de la rexón de la molécula que va ser amplificada.

Estensión o elongación de la cadena

Actúa la polimerasa, tomando l'ADN molde pa sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesariu pa la síntesis de nuevu ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra d'ADN complementaria a la hebra molde añadiendo los dNTP complementarios en direición 5'→ 3', xuniendo'l grupu 5'-fosfatu de los dNTP col grupu 3'-hidroxilo del final de la hebra d'ADN creciente (la cual estiéndese). La temperatura pa esti pasu depende del ADN polimerasa qu'usemos. Pa la polimerasa Taq, la temperatura de máxima actividá ta en 75-80 °C (comúnmente 72 °C). El tiempu d'estensión depende tantu del ADN polimerasa usada como del llargor del fragmentu d'ADN que se va a amplificar. Hai una regla comúnmente usada: na so temperatura óptima, la polimerasa d'ADN polimerizará mil bases nun minutu.

Elongación final

Etapa única que se lleva a cabu a una temperatura de 70-74 °C mientres 5-15 minutos tres l'últimu ciclu de PCR. Con ella asegúrase que cualquier ADN de cadena simple restante sía totalmente ampliáu.

Caltenimientu

Este ye un pasu que se lleva a cabu a 4-15 °C mientres un tiempu indefiníu pa caltener la reacción al curtiu plazu.

La PCR de normal realízase con un volume de reacción de 15-100 μL, en pequeños tubos de 0.2-0.5 mL que s'asitien nel termociclador.

Pa verificar que la PCR xeneró'l fragmentu d'ADN previstu, empléguense téuniques d'electroforesis, que dixebren los fragmentos d'ADN xeneraos d'alcuerdu a la so carga, esto ye, llargor, y, en menor midida y dependiendo de la matriz emplegada, al so tamañu: típicamente empléguense la electroforesis en xel de agarosa, pa fragmentos grandes; n'acrilamida, pa los más pequeños; y, de forma más rápida y aplicable a la PCR acomuñada a marcaje fluorescente, la electroforesis capilar.[4] El/los tamañu/s de los productos de la PCR vienen determinaos por un marcador de pesu molecular d'ADN, que contién fragmentos d'ADN de tamañu conocíu, y que se cuerre nel xel xunto colos productos de PCR.

Optimización de la PCR

Na práutica, la PCR puede fallar por delles razones, ente elles:

  • La PCR ye una téunica de gran sensibilidá, esto ye, precisa una mínima cantidá d'ADN pa llograr un gran númberu de copies. Amás, pue ser bien propensa a error si llevar a cabu en condiciones desaparentes d'esterilidá, que conduzan a l'amplificación d'ADN non correspondiente a la muestra a analizar (y por tanto a conclusiones inciertes). Haber de tomar una serie de procuros pa evitar la contaminación con ADN estrañu. Exemplos nos que ye especialmente importante evitar l'amplificación son la detección d'enfermedaes (para nun diagnosticar equivocadamente a los pacientes) o'l diagnósticu d'identidá y parentescu. Posibles procuros son:
    • Tener especial curiáu mientres los pasos previos a l'amplificación: recoyida, unviada, custodia y procesáu de muestres.
    • Llimpieza refecha y esterilización (llexía, etanol, lluz UV, psoralenos...) de la superficie de trabayu ente la realización d'una PCR y la siguiente.
    • En llaboratorios de diagnósticu xenéticu, suélense tener árees separaes de trabayu: un llaboratoriu pa la preparación de entemecer madre pa la PCR, otru pa la adición del ADN a amplificar, otru onde s'atopa la maquinaria pa realizar la PCR y otru onde s'abrir y analiza la muestra yá amplificada.
    • Cabines de seguridá biolóxica p'amenorgar vapores cargaos de amplicones d'enfermedaes.
    • Proteición fayadiza de los operarios que manipolien les muestres y los preseos del llaboratoriu: guantes, bata, cubrezapatos, gafes de seguridá, pelo recoyíu... Nel diagnósticu molecular ye conveniente que se camuden estos elementos al pasar d'una zona de trabayu a otra.
    • Controles positivos y negativos.
    • Tipado de tol personal del llaboratoriu. Nel casu d'atopar una amplificación ensin esperar podrá comprobase si provién d'unu de los operarios.
  • Les téuniques de diseñu de cebadores son importantes na meyora del llogru de productos de PCR y n'evitar la formación de productos falsos. Delles considerancies al diseñar estos cebadores son:
    • Encamiéntase usar primers de más de 15 nucleótidos (18-30 nn) De normal, suélense diseñar de 20 nucleótidos. Los cebadores bien curtios faen que nuesa PCR nun sía bien específica, y los que s'entepasen en llargor van faer que perdamos rendimientu na reacción.
    • Los primers nun tienen de diferir en más de 3 bases.
    • La proporción ente bases púricas y pirimidínicas de los dos oligos sía 1:1 (40-60% a lo sumo), y qu'empiecen y terminen con 1 o 2 bases púricas.
    • Ríquese una distribución homoxénea de los cuatro nucleótidos na secuencia, evitando los poliT/A/G/C.
    • La Tm (melting temperature) de los oligos nun puede diferir en más de 5 °C.
    • Los cebadores nun tienen d'incluyir na so secuencia rexones que sían complementaries ente sigo, o se van formar dímeros ente ellos.
  • Esiste una gran variedá de polimerases disponibles, pudiendo escoyer la que más s'axuste a les nueses necesidaes. Por casu, dalgunes tienen actividaes inesistentes n'otres o les realicen de forma más eficiente, o funcionen n'intervalos de temperatura nos cualos otres se desnaturalizan o pierden funcionalidad. Les más habituales son la taq y la pfu.
  • Los componentes del tampón de reacción tendrán d'afaese a les esixencies de nueses enzimes.
  • El termociclador, poques gracies, tien de ser capaz de reproducir correutamente los ciclos de la PCR: pa ello, diverses cases comerciales van ufiertanos termocicladores ellaboraos con materiales que faigan más eficaces el desenvolvimientu y l'intre de les etapes, amás de diverses facilidaes de manexu. Dientro del llaboratoriu, el so manexu, caltenimientu y allugamientu va ser clave.

Amás de aspeutos como la contaminación y dalgún fallu na hibridación de primers, puede haber otres complexidaes qu'afecten a la PCR, como son:

  • Degradación del ADN: esto puede asoceder cuando se manipolia la muestra en condiciones subóptimas o cuando se fai una autopsia, por casu, y resulta n'ausencia d'amplificación o resultancies parciales. Un casu particular ye'l "allele dropout", o bien perda d'un apanfilo, que puede llegase a confundir con ser homocigótico pa dichu apanfilo.
  • Inhibición de la PCR: puede haber axentes qu'interfieran nel correutu intre de la PCR. Va Riquir un procesamientu adicional de la muestra pa esaniciar estos compuestos del mediu antes de preparar l'amiestu de PCR. Tanto la sangre como'l semen contienen esti tipu de inhibidores, polo que ye necesariu una purificación previa.
  • Cambéu del ADN: les sustancies como'l formol (emplegáu en caltenimientu de texíos) o la lluz ultravioleta modifiquen l'ADN, alteriando asina los resultaos de l'amplificación.
  • Artefautos: pueden dase situaciones como les bandes "stutter" o "shadow", que consisten en que la polimerasa amplifica una repetición de más d'un microsatélite o repetición en tándem.
  • Apanfilo fora de patrón: un apanfilo amplificáu puede nun coincidir col patrón de picos de la referencia. Esto ye señal de que daqué foi mal mientres la PCR.
  • Amiestos: ye posible que dos amuesen entemecer de dalguna forma y la resultancia sía una combinación del patrón de picos que cabo esperar tres l'amplificación de caúna d'elles por separáu. Esto y el casu anterior enzanca la interpretación de los resultaos.

Tipos de PCR

PCR añerada

Téunica bien sensible de PCR na que'l productu d'una amplificación ye utilizáu como molde pa realizar una segunda amplificación con cebadores que s'alluguen dientro de la primer secuencia amplificada, esto ye, cuando tenemos el primer, como la so amplificación pueden xunise los cebadores y faise de nuevu una amplificación dientro del amplicón inicial. Esti tipu de PCR tien la ventaya de brindar alta sensibilidá y especificidá. La especificidá aumenta porque como ye amplificación d'un amplicón llográu primeramente, los cebadores namái van hibridar nun sitiu dientro de la molécula y la resultancia va ser una única banda. Asina, evitamos posibles hibridaciones inespecífiques de los cebadores. La desventaxa d'esta téunica ye que nun nos dexa cuantificar la muestra.

PCR d'estensión asolapada (Mutagénesis)

Introdúcense cambeos de secuencia dientro de fragmentos (clonaos) d'ADN. Ríquense 2 cebadores (primers) mutagénicos y otros 2. Amplifícase un fragmentu 5' y un fragmentu 3' que s'asolapen portando dambos la mutación. Úsense los productos n'otra reacción pa producir l'ADN mutáu de llargor completu.

PCR in situ

La PCR in situ consiste nuna reacción de PCR en seiciones histolóxiques o célules, onde los productos xeneraos pueden visualizase nel sitiu d'amplificación. Ye realizada sobre preparaciones fixes nun portaoxetos. Na téunica de PCR in situ realízase una primer amplificación d'ADN blancu y depués detección por aciu hibridación in situ convencional con sondes d'ADN/ARN. D'esta manera pueden detectase cantidaes perpequeñes de xenoma. Esta teunoloxía ye de gran algame na capacidá d'amplificar específicamente una población de secuencies de menor representación.

PCR múltiple

PCR na cual amplifícase simultáneamente más d'una secuencia. Pa ello, combínense dos o más pares de cebadores nun mesmu tubu, xunto col restu de los reactivos de la reacción en cantidaes abondes, p'amplificar simultáneamente dellos segmentos d'ADN. Ventayes: información sobre dellos locus nuna sola reacción, menor cantidá de molde pal analís, menor cantidá de reactivos, rápida construcción de bases de datos. Desventaxes: pa llevala a cabu afechiscamente y ensin errores, riquir d'una cuidadosa optimización del procesu.

PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR)

Ye una variante de la PCR na qu'usamos ARN como molde inicial en cuenta de ADN, y emplega una transcriptasa inversa (como Tth) pa realizar la síntesis d'un ADN complementariu al ARN (ADNc). D'esta forma, el desenvolvimientu inicial d'una RT-PCR sería:

  • 1ᵉʳ pasu: retrotranscripción a partir del ARN.
  • 2º pasu: amplificación a partir de la primera hebra de ADNc.
  • 3ᵉʳ pasu: PCR estándar.

PCR en tiempu real o PCR cuantitativu (qPCR)

Reacción de PCR que la so principal carauterística ye que dexa cuantificar la cantidá d'ADN o ARN presente na muestra orixinal, o pa identificar con una bien alta probabilidá, muestres d'ADN específiques a partir de la so temperatura de fusión (tamién denomináu valor Tm, del inglés melting temperature).

Puede estremase nes téuniques basaes en fluorocromos non específicos y nes téuniques basaes en sondes específiques.

Nes téuniques basaes en fluorocromos l'ADN, que ve multiplicada la so cantidá con cada ciclu, xunir al fluorocromo (xeneralmente SYBR Green) produciendo fluorescencia que ye midida pol termociclador aptu pa PCR en tiempu real. Dexa cuantificar namái una secuencia por reacción pero tien la ventaya d'utilizar cebadores normales pa la so realización. Ye muncho más económica que la qu'usa sondes específiques.

Les téuniques basaes en sondes específiques utilicen una sonda xunida a dos fluorocromos qu'hibrida na zona entemedia ente'l cebador direutu (forward) y l'inversu (reverse); cuando la sonda ta intacta, presenta una tresferencia enerxética de fluorescencia per resonancia (FRET). Felicidad FRET nun se produz cuando la sonda ta estropiada y los dos fluorocromos tán distantes, productu de l'actividá 5'-3' exonucleasa del ADN polimerasa. Esto dexa monitorizar el cambéu del patrón de fluorescencia y deducir el nivel d'amplificación del xen.

La mayoría d'estos inconvenientes solucionáronse cola introducción de la PCR realizada en tiempu real (Q-PCR), qu'esanicia cualquier procesu post-PCR yá que monitoriza la progresión de l'amplificación nel momentu que asocede. A diferencia de la PCR convencional (en puntu final), que mide l'acumuladura del ADN a la fin d'un númberu predeterminado de ciclos, con Q-PCR esto fai mientres el procesu d'amplificación usando fluorescencia, de forma que'l so aumentu ye proporcional a la cantidá d'ADN formada. El procesu puédese automatizar fácilmente usando un sistema que realice l'amplificación (termociclador) y que de la mesma sía capaz de lleer fluorescencia. Esiste una amplia ufierta d'aparatos nel mercáu. La mayoría pueden trabayar coles diverses opciones de marcáu fluorescente y son "abiertos", esto ye, dexen programar les condiciones d'amplificación y llectura de forma que'l so usu nun queda llindáu a unos reactivos determinaos.

Téunica TaqMan
Téunica TaqMan

Variaciones de la PCR básica

  • PCR específica d'apanfilo: esta téunica de diagnósticu o clonación ye usada pa identificar o utilizar los polimorfismos d'una sola base (SNPs). Utiliza cebadores específicos pa les secuencies normal y mutante. El diseñu más habitual ye un analís en dos tubos con dos cebadores: unu normal y otru mutante en reacciones separaes xunto colos cebadores control.
  • PCR "assembly": consiste na síntesis artificial de llargues secuencies d'ADN, realizando pa ello la PCR nun fondu de oligonucleótidos llargos con secuencies solapantes curties.
  • PCR asimétrica: usada p'amplificar preferentemente una cadena del ADN orixinal con al respeutive de la otra.
  • PCR de colonia: por aciu esta téunica, colonies de bacteries Escherichia coli pueden ser rápido esaminaes pa construcciones vidables de vectores d'ADN.
  • Amplificación dependiente de helicasa: esta téunica ye bien paecida a la PCR convencional, pero nella emplega la enzima helicasa y una temperatura constante en llugar de la polimerasa d'ADN y los ciclos repitíos d'hibridación-elongación.
  • PCR hot-start: esta téunica amenorga l'amplificación inespecífica mientres les etapes iniciales de la PCR: ente que la máquina algama la temperatura de la primer etapa (unos 95 ℃) pue que asoceda la unión de los cebadores y prodúzase amplificación, yá que nel camín p'algamar estos 95 ℃ pasar pola temperatura de anillamiento (que ye más baxa).
Pa evitar esto, la PCR hot-start basar en que la reacción empiece cuando la máquina yá tea a 95º, por cuenta de qu'antes nun s'atopen presentes la polimerasa o'l cloruru de magnesiu, lo que podemos consiguir por aciu delles téuniques:
- Añadir la polimerasa o'l cloruru de magnesiu tres el periodu de calentamientu ::-

Dixebrar por una capa de cera los distintos componentes de la reacción. La cera fundir al algamar los 95 ℃ y ye entós cuando los componentes entren en contautu ::- Anticuerpos anti-polimerasa que tean bloquiando a la polimerasa. Al algamar los 95 ℃ estos anticuerpos se inactivan por cuenta de que se desnaturalizan y la polimerasa puede actuar

  • PCR específica de intersecuencia (ISSR): tratar d'un métodu de PCR pal so usu en buelga xenética, qu'amplifica rexones ente repeticiones de secuencia simple pa producir una buelga xenética única de llargores de fragmentu amplificaes.
  • PCR inversa: ye un métodu usáu pa poder realizar la PCR cuando namái ye conocida una secuencia interna. Bien útil na identificación de secuencies que flanquean insertos genómicos.
  • PCR mediada por ligación: esti métodu usa pequeños linkers d'ADN amestaos al ADN d'interés y múltiples cebadores hibridando estos linkers.
  • PCR específica de metilación (MSP): usar pa detectar metilaciones n'islles CpG d'ADN genómico.
  • Amplificación Múltiple Dependiente de Sonda (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification o MLPA): dexa amplificar delles secuencies oxetivu con un únicu par de cebadores, evitando asina les llimitaciones de resolución de la PCR multiplex.
  • PCR cuantitativa: usar pa midir la cantidá d'un productu de PCR. Na téunica clásica de PCR, se cuantifica por aproximamientu con diluciones y amplificación de concentraciones conocíes de secuenciar diana. Tamién se puede cuantificar por métodu competitivu: trabayar con concentraciones crecientes conocíes d'un fragmentu que puede ser amplificáu polos mesmos oligos que la muestra d'estudiu, pero de menor tamañu qu'ésta, de forma que coles resultancies llograes puede envalorase qué concentración del competidor ye equivalente a la de la muestra de cantidá desconocida. La cuantificación en PCR ta optimizada na téunica de PCR en tiempu real.
  • PCR-TAIL: la PCR termal d'enxareyáu asimétricu ye usada p'aisllar una secuencia desconocida que flanquea una secuencia conocida.
  • PCR touchdown: tratar d'una variante de la PCR que s'emplega cuando se desconoz la secuencia exacta de los estremos de la secuencia a amplificar, de cuenta que s'asume que puede esistir dalguna base desapareada na alliniadura cebadora-secuencia. La so finalidá ye amenorgar el fondu non específicu baxando gradualmente la temperatura d'hibridación a lo llargo del progresu de la PCR.
  • PAN-AC: esti métodu usa condiciones isotermas pa l'amplificación, y puede ser usáu en célules vives.
  • Ciclu térmicu rápidu pa PCR:[5] L'amplificación del DNA puede llevase a cabu rápido, como completar 30 ciclos en menos de 30 minutos: ciclu térmicu rápidu. De normal consideróse que les etapes de cada ciclu son trés reacciones qu'asoceden en tres periodos separaos y a tres temperatures distintos. Esti paradigma del equilibriu secuencial nun tien en cuenta que la temperatura de la muestra nun camuda instantáneamente, ello ye que mientres una PCR la muestra ta la mayoría del tiempu en temperatures de transición. El ciclu térmicu rápido aprovecha la ventaya de la instantánea desnaturalización y hibridación, que les sos temperatures precisen algamar, pero nun caltenese. Amás, pa productos curtios, la estensión puede llevase a cabu mientres la transición a la temperatura d'estensión, y poro, tampoco ye necesariu caltenela. Un ciclu rápido podría entós describise como 94 °C, 0 s; 55 °C, 0 s y 72 °C, 0 s. Como vemos, esti modelu non ayuda, porque nos lleva solo a temperatures estremes y nun nos da información sobre lo que pasa ente elles. Sicasí, nel paradigma cinéticu pa PCR de ciclu rápido descríbese dafechu l'historial de temperatures de la muestra. Considérase que desnaturalización, hibridación y elongación asoceden nun rangu de temperatures y amás pueden asolapar temporalmente. Hai termocicladores que dexen qu'un ciclu completar en 20-60 segundos, polo que 30 ciclos tarden de 10 a 30 minutos.

Aplicaciones

La téunica de la PCR tien ensame d'aplicaciones: yá en ciencia básica, como ferramienta de detección y/o xeneración de mancomunes de fragmentos d'ADN d'interés; yá en ciencia aplicada, como elementu escuédigu en sí mesmu, por casu en diagnósticu clínicu.

Investigación

La PCR convencional, emplégase como base pa ensame de téuniques nel llaboratoriu por cuenta del so robustez y rapidez. D'esta miente, la PCR de puntu final dexa controlar y detectar los fragmentos d'ADN d'interés.

Clonación d'un segmentu d'ADN por aciu amplificación con cebadores que contienen una secuencia apta pa la recombinación dirixida con un plásmido.

Una aplicación de la PCR d'estrema importancia ye la clonación de secuencies d'ADN en vectores, como pueden ser los plásmidos. Pa ello, empléguense cebadores que contienen nel so estremu 5' una curtia secuencia que dexa la interacción posterior con otra complementaria asitiada nel vector de clonación a emplegar. Por casu, puede incluyise una diana de restricción en dichos cebadores, de cuenta que, y si ésta nun esistía primeramente nel fragmentu y ye única nel vector, pueda efeutuase una ligación por aciu la ligasa de T4 tres la dixestión cola enzima de restricción apoderada de dambos elementos. Otru métodu asimilable a esta vía ye l'empléu de la recombinación empobinada; esto ye, afacer al 5' de los cebadores una secuencia que faculta a una recombinasa la recombinación empobinada con un vector dau.[6]

Medicina

En medicina, la PCR emplégase fundamentalmente como ferramienta de diagnosis (Coleman y Tsongalis, 2006):

  • Una de les principales aplicaciones de la PCR ye faer pruebes xenétiques pa detectar mutaciones nel ADN que provoquen dalgún tipu d'enfermedá.El diagnósticu d'enfermedaes hereditaries presentes nel xenoma ye un procesu llargo y complicao que puede encurtiase significativamente gracies a la PCR. Asina, pueden faese analís del ADN de los futuros padres pa ver si son portadores, o analizar l'ADN de los sos fíos por si tán afeutaos por una enfermedá hereditaria. Pal analís prenatal, les muestres d'ADN pueden llograse a partir de l'amniocentesis, de la muestra de les vellosidaes coriónicas o inclusive a partir de delles célules fetales que circulen pola riega sanguineu de la madre. L'usu de la PCR tamién ye esencial pal diagnósticu xenéticu preimplantacional onde pueden analizase les célules del embrión pa buscar posibles mutaciones.
  • Dexa'l genotipar la especie o especies que provoquen un determináu cuadru infeiciosu: pa ello, amplifícase una zona del xenoma bacterianu que'l so productu de PCR tenga unes carauterístiques de tamañu o temperatura de fusión que dexen identificalo de forma inequívoca. Nel casu d'infeiciones virales qu'impliquen la integración del xenoma del patóxenu nel ADN del hospedador, como ye'l de la infeición por VIH, la PCR cuantitativa fai posible la determinación de la carga viral esistente y por tanto, del estadiu de la enfermedá.[7]
  • La PCR tamién puede usase en revisiones médiques rutinaries, como nos servicios de donantes de sangre, pa test de rutina. Al traviés d'esta téunica pueden detectase infeiciones nel donante (como VIH o Hepatitis B) mientres entá tán nel periodu d'incubación. Dada la sensibilidá de los test de PCR pueden tomase muestres coleutives o "pools" (por casu, 96 pruebes individuales). Si una d'estes muestres coleutives da positivu, tomar a partir d'ella muestres progresivamente menores hasta que s'atope'l causante.
  • Tamién puede usase la PCR como parte de les pruebes realizaes cuando se fai un tresplante de texíos. En 2008 propúnxose usar esta téunica pa reemplazar les pruebes tradicionales con anticuerpos.[8]
  • Dacuando, por aciu la PCR pueden faese terapies personalizaes pa pacientes con ciertos tipos de cáncer que producen mutaciones nos oncogenes a partir de la detección d'estes mutaciones.

Paleontoloxía, antropoloxía biolóxica, y ciencies forenses

Los campos de la paleontoloxía, antropoloxía biolóxica y la medicina y antropoloxía forense viéronse descomanadamente beneficiaos por esta téunica, yá que toes elles constrúin con frecuencia la conocencia de les sos correspondientes disciplines gracies a restos o buelgues de seres vivos. Unu de los materiales biolóxicos que más información puede apurrir ye l'ADN.
La relativa estabilidá d'ésti dexa que, anque estazáu, caltener mientres llargos periodos si les condiciones son aparentes.[6] N'ocasiones les muestres intactes coles que puede cuntase son extraordinariamente pequeñes o tán deterioraes. La PCR soluciona dambos problemes y apurre cantidaes útiles pa posteriores pasos d'analises. En primer llugar aumenta la cantidá de material recuperáu a partir de muestres escases, yá que como yá se dixo enantes, en teoría basta una sola molécula por que'l procesu pueda tener llugar. Tamién por cuenta de la naturaleza de la téunica y el so propósitu d'amplificación de fragmentos pequeños, esta fragmentación nun torgar qu'esti ADN pueda ser emplegáu como molde pa una reacción de PCR.

  • En paleontoloxía y Antropoloxía la PCR dexa recuperar les escases cantidaes d'ADN qu'entá nun se degradaron. Dellos llugares en que l'ADN podría caltenese son la brea les cenices volcániques, el ámbare, xelos históricos polares o glaciares y ambientes grebos, sedimentos, según nos cristales d'apatita de restos de cadarma,[9] siendo posible d'esa manera carauterizar cadabres, fósiles o otros restos por aciu genotipado por analís de microsatélites o inclusive xenomes de taxones estinguíos, amplificaos d'esta miente, como pueden ser los realizaos por aciu l'ADN genómico del home de Neanderthal.[10] El propósitu sería utilizar esti ADN amplificáu pa darréu realizar estudios filoxenéticos o etnográficos o de poblaciones por aciu la comparanza de secuencies d'ADN, o l'estudiu de les causes de la separación evolutiva de dos especies.
  • Nes ciencies forenses emplegar pa establecer la filiación d'una persona o pa llograr pruebes a partir de muestres mínimes dexaes pol autor d'un crime como cuspia, semen o otros restos de texíos (Butler, 2005).

Agronomía y diversidá

Tal que la PCR multiplex dexa producir buelgues xenétiques d'individuos concretos, dientro del marcu de la xenética forense, esisten métodos basaos na PCR que dexen discernir ente grupos infraespecíficos de cultivos d'interés agronómicu; por casu, de cultivares.[11] Pa ello, empléguense oligonucleótidos d'un tamañu lo suficientemente pequeñu como por que ceben de forma relativamente inespecífica, anque siempres de tala forma que produzan un patrón de bandes discretu y interpretable. D'esta miente, la pauta llograda tres la electroforesis de los fragmentos tiende a arrexuntar a los individuos de mayor semeyanza, que tienen un comportamientu similar, de los que diverxen.

Historia

Electroforesis de proteínes SDS-PAGE resolviendo la polimerasa Taq.

En 1971, un artículu publicáu por Kleppe et al. en Journal of Molecular Biology describió per primer vegada un métodu qu'usaba enzimes pa retrucar una secuencia pequeña d'ADN con cebadores in vitro.[12] Sicasí, esti tempranu exemplu del principiu básicu de la PCR nun recibió muncha atención, y l'invención de la reacción en cadena de la polimerasa en 1983 ye xeneralmente atribuyida a Kary Mullis.[13][14] Mullis ganó'l Premiu Nobel pol so trabayu en PCR.

Daqué bien a tener en cuenta na PCR ye que l'ADN polimerasa que s'use sía capaz de soportar les altes temperatures de >90 °C necesaries pa la separación de los dos hebras d'ADN de la doble héliz tres cada ciclu de replicación. Los ADN polimerasas que s'utilizaron orixinariamente pa los esperimentos in vitro previos a la PCR nun yeren capaces de soportar estes altes temperatures, polo que los primeros procedimientos pa retrucar l'ADN yeren bien ineficientes, llongures y riquíen grandes cantidaes d'ADN polimerasa.

El descubrimientu en 1968 de la polimerasa Taq, una polimerasa d'ADN estrayida de la bacteria termófila Thermus aquaticus qu'habita medios de bien alta temperatura (50-80 °C), esanició los grandes inconvenientes del métodu de la PCR. Esti ADN polimerasa ye estable a altes temperatures, permaneciendo activa hasta dempués de la desnaturalización del ADN, esaniciando la necesidá d'añader a la reacción nueva polimerasa tres cada ciclu. Esti descubrimientu dexó automatizar el procesu, antes tan aburrible, acoplándolo al usu del termociclador.

Coles mesmes que desenvolvía la PCR en 1983, Mullis trabayaba en Emeryville, California (EE UU), pa una de les primeres empreses bioteunolóxiques, Cetus Corporation, onde yera responsable de sintetizar cadenes curties d'ADN. Mullis afirma que concibió la idea pa la PCR una nueche mientres cruciaba l'Autopista de la Mariña Pacífica (EE UU) nel so coche.[13] Taba imaxinando una nueva forma d'analizar mutaciones nel ADN cuando se decató de que, en llugar d'eso, inventara un métodu p'amplificar rexones específiques d'ADN por aciu ciclos de duplicación repitíos usando ADN polimerasas. Mullis atribúi la invención d'esta téunica a los efeutos de la droga sicodélica y alucinógena LSD.[15]

Na revista Scientific American, Mullis resumió'l procedimientu: "Empezando con una única molécula del material xenético ADN, la PCR puede xenerar 100 billones de molécules iguales nuna tarde. La reacción ye bono de faer, nun riquir más qu'un tubu de pruebes, unos pocos reactivos simples y una fonte de calor".[16] Foi premiáu col Premiu Nobel de Química en 1993 pola so invención, y siete años dempués, él y los sos colegues del Cetus llevaron a la práutica la so propuesta. Sicasí, apaecieron discutinios y distintes versiones sobre les contribuciones intelectuales y práutiques d'otros científicos al trabayu de Mullis, y sobre si él foi l'inventor únicu del principiu de la PCR.

Guerres de patentes

La téunica de la PCR foi patentada por Cetus Corporation, onde Mullis trabayaba cuando inventó la téunica en 1983. La enzima polimerasa Taq foi tamién cubierta de patentes. Tuvieron llugar varios pleitos rellacionaos cola téunica, incluyendo un pleitu fracasáu xeneráu por DuPont. La compañía farmacéutica Hoffmann-La Roche adquirió los derechos de les patentes en 1992 y anguaño caltién les qu'entá tán protexíes.[17][18]

Ver tamién

  • NASBA (Nucleic acid sequence based amplification o amplificación isotérmica d'ácidos nucleicos)

Referencies

  1. ↑ Bartlett & Stirling (2003)—A Short History of the Polymerase Chain Reaction. In: Methods Mol Biol. 226:3-6
  2. ↑ History of Polymerase Chain Reaction (PCR)
  3. 1 2 Joseph Sambrook and David W. Russel (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 0-87969-576-5.
  4. ↑ Mathews, C. K.; Van Holde, K.Y et Ahern, K.G (2003). «6», Bioquímica, 3, páx. 204 y ss. ISBN 84-7892-053-2.
  5. ↑ PCR Applications. Protocols for functional genomics. Capítulu 14. Edited by Michael A. Innis, David H. Gelfand, John J. Sninsky. ISBN 0-12-372186-5, Academic Press 1999
  6. 1 2 Watson, J, D.; Baker, T. A.; Bell, S. P.; Gann, A.; Levine, M. et Losick, R (2004). Molecular Biology of the Gene, Fifth edition, San Francisco: Benjamin Cummings. ISBN 0-321-22368-3.
  7. ↑ Scott L. Butler, Mark S.T. Hansen & Frederic D. Bushman (2007). «A quantitative assay for HIV DNA integration in vivo». Nature Medicine (7):  páxs. 631-634. doi:10.1038/87979. http://www.nature.com/nm/journal/v7/n5/abs/nm0501_631.html.
  8. ↑ Quill Y "Blood-Matching Goes Genetic" Science Magacín (14 March 2008) páxs. 1478-1479.
  9. ↑ Muséu Victora de Melbourne sobre la preservación del ADN
  10. ↑ James P. Noonan,Graham Coop, Sridhar Kudaravalli, Doug Smith, Johannes Krause, Joe Alessi, Feng Chen, Darren Platt, Svante Pääbo, Jonathan K. Pritchard, Edward M. Rubin (17 de payares de 2006). «Sequencing and Analysis of Neanderthal Genomic DNA». Nature Medicine 314 (5802):  páxs. 1113-1118. DOI: 10.1126/science.1131412. http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/314/5802/1113.
  11. ↑ Jinguo Hu1 and Carlos F. Quiros (1991). «Identification of broccoli and cauliflower cultivars with RAPD markers». Plant Cell Reports 10 (10). DOI: 10.1007/BF00234583. http://www.springerlink.com/content/t6082o1363g08567/fulltext.pdf.
  12. ↑ Kleppe K, Ohtsuka Y, Kleppe R, Molineux I, Khorana HG (1971). «Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases». J. Mol. Biol. 56:  páxs. 341-361. http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6WK7-4DKM9WR-36&_user=103681&_coverDate=03%2F14%2F1971&_rdoc=10&_fmt=summary&_orig=browse&_srch=doc-info(%23toc%236899%231971%23999439997%23524037%23FLA%23display%23Volume)&_cdi=6899&_sort=d&_docanchor=&view=c&_ct=18&_acct=C000007920&_version=1&_urlVersion=0&_userid=103681&md5=5y1y29y72y51ebd62d1b60d1bd5f9058.
  13. 1 2 Mullis, Kary (1998). Dancing Naked in the Mind Field. Nueva York: Pantheon Books. ISBN 0-679-44255-3.
  14. ↑ Rabinow, Paul (1996). Making PCR: A Story of Biotechnology. Chicago: University of Chicago Press. ISBN 0-226-70146-8.
  15. ↑ Mullis, Kary (1998). Dancing Naked in the Mind Field. Nueva York: Pantheon Books, páx. 18. ISBN 0-679-44255-3.
  16. ↑ Mullis, Kary (1990). «The unusual origin of the polymerase chain reaction». Scientific American 262 (4):  páxs. 56-61, 64-5.
  17. ↑ PR Newswire
  18. ↑ Conseyos sobre cómo sobrevivir a la guerra de les patentes de Taq: XEN Genetic Engineering News Biobusiness Channel: Artículos. 1 de mayu de 2006 (Vol. 26, Non. 9).

Bibliografía

  • Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, et al.(1988) Primer-direuted enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239: 487–491
  • Griffiths, J.F. A. et al. (2002). Xenética. McGraw-Hill Interamericana. ISBN 84-486-0368-0.
  • Coleman, WB y Tsongalis, GJ (2006). Molecular Diagnostics: For the Clinical Laboratorian. Humana Press. ISBN 1-58829-356-4.pgs. 47-56 y 65-74
  • Butler, JM (2005). Forensic DNA Typing: Biology, Technology, and Genetics of STR. Academic Press pgs 63-84. ISBN 0-12-147952-8.

Enllaces esternos

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