Consideración previes

Pa entender el mecanismu subxacente al procesu de fluorescencia ye necesariu primero repasar el conceutu d'orbital atómicu y d'orbital molecular.

Los electrones nun átomu entámense ocupando distintos orbitales, esto ye, rexones nel espaciu en redol al nucleu onde esiste una cierta probabilidá d'atopalos. Esisten orbitales de baxa enerxía y orbitales d'alta enerxía. Los electrones prefieren ocupar primero, y siempres que seya posible, los orbitales de menor enerxía que s'atopen sacupaos. Sicasí esto nun significa que nun puedan ocupar transitoriamente orbitales de mayor enerxía.

Transiciones electróniques

Pa mover un electrón d'un orbital de baxa enerxía a un orbital de mayor enerxía ye necesariu cubrir esa diferencia d'enerxía con un apurra esternu (ye cuasi como llevar un cuerpu d'un llugar baxu a un llugar con ciertu altor, cola diferencia de qu'a escala atómica la diferencia d'enerxía ente orbitales atópase cuantizada). Pa cada tipu d'átomu la diferencia d'enerxía ente dos orbitales daos ye constante y los electrones pueden movese ente esos orbitales namái ganando o perdiendo esa cantidá fixa d'enerxía. Esti procesu conozse como transición electrónica. Nel casu de tratase d'átomos únicos esto provoca que cada tipu d'átomu tenga llinia d'absorción y llinies d'emisión bien carauterístiques, ye dicir que seya capaz d'absorber o emitir enerxía en forma de cuantos de lluz a determinaos llonxitúes d'onda correspondientes a cada unu de los procesos de saltu de los electrones ente orbitales de distinta enerxía. Nel casu d'átomos únicos les llinies espectrales son bien precises y definíes porque les transiciones ente distintes orbitales tienen diferencies d'enerxía bien marcaes y precises.

Espectros moleculares

Cuando los átomos combinar pa formar molécules, los sos orbitales atómicos sumen, combinándose pa formar orbitales moleculares. Los electrones agora pueden ocupar rexones de probabilidá en redol a dellos nucleos. La combinación d'orbitales atómicos producir en forma llinial, esto significa por casu que si se combinen dos átomos, cada unu de los cualos tien cuatro orbitales atómicos, la molécula va tener como resultáu ocho orbitales moleculares. Estos orbitales moleculares van tener enerxíes entemedies a les de los orbitales atómicos que se combinaron pa formalos. La situación va tornándose más complexa cuantos más átomos tenga una molécula. De resultes molécules relativamente simples tienen un númberu bien alzáu d'orbitales moleculares ente los cualos pueden producise transiciones electróniques. Ye por eso que les molécules tienen bandes d'emisión y absorción y non llinies. Estes bandes atópense formaes pola superposición d'una gran cantidá de llinies correspondientes a caúna de les transiciones posibles ente distintes orbitales dientro de la molécula. Y pa complicar entá más la situación, hai que considerar que les molécules nun son ríxides, sinón que se trata d'estructures dinámiques que tán sometíes a deformaciones estructurales, debíes por casu a vibraciones térmiques o a rotaciones de determinaes partes de la molécula. Cuando s'alteria la forma d'una molécula, tamién s'alteria la forma de los orbitales moleculares que la formen y de resultes altériase la enerxía de los mesmos. Les deformaciones estructurales provoquen llixeres diferencies ente les enerxíes de distintes orbitales que faen que se modificar les enerxíes de transición electrónica ente elles. Finalmente cabo considerar que nuna molécula n'estáu basal, munchos de los electrones atópase en estáu singlete, esto ye, atópense complementaos por otru electrón dientro del mesmu orbital con un espín antiparalelo. Una transición electrónica típica, implica qu'un electrón n'estáu singlete, salta a un orbital de mayor enerxía adquiriendo un tao doblete onde'l so espín nun s'atopa complementáu por otru antiparalelo. Pero pueden asoceder otru tipu de transiciones, na cual dos electrones en tao doblete, pueden ser promovíos a dos orbitales dexeneraos (d'igual enerxía) adquiriendo un tao triplete nel cual los sos espines son paralelos. Les transiciones de espín, tamién pueden absorber y emitir enerxía en forma de lluz.

Mecanismu básicu y diagrama de Jablonski

Un diagrama de Jablonski ye básicamente una representación simplificada de los niveles electrónicos (orbitales) d'una molécula y de les posibles transiciones electróniques que pueden dase ente estos niveles. Nuna diagrama de Jablonski arrexuntar verticalmente los estaos electrónicos d'alcuerdu a la so enerxía y horizontalmente d'alcuerdu a la so multiplicidá de espín. Les transiciones radiativas representar con llinies rectes y les non radiativas con llinies ondulaes. De siguío preséntase una diagrama de Jablonski modificáu pa representar una molécula hipotética que tien un nivel electrónicu basal (S₀) dos niveles electrónicos d'alta enerxía (S₁ y S₂) y un nivel de dos orbitales dexeneraos con espines paralelos (triplete T₁) cada unu d'estos niveles con dellos subniveles vibracionales debíos a les deformaciones térmiques de la molécula (Vb). Na exa vertical allúgase la enerxía relativa de cada nivel electrónicu, y na exa horizontal consideremos al tiempu y non a la multiplicidá de espín. Les fleches verticales representen absorciones y emisiones d'enerxía en forma de fotones y les fleches diagonales impliquen disipación d'enerxía por medios non radiativos (en forma de calor).

La situación equí representada empieza pola promoción d'un electrón que s'atopaba n'estáu basal S₀ a un nivel electrónicu d'alta enerxía S₂ nun estáu vibracional altu (la llinia Vb más alta de toes). Esta promoción produzse cuando la molécula absuerbe enerxía, polo xeneral en forma d'un cuanto de lluz (fotón). Esti electrón nun estáu electrónicu escitáu vibracionalmente alto puede dexar parte de la so enerxía en forma de vibraciones que se tresmiten al restu de la molécula (flecha mariella diagonal retulada como NR). Esta enerxía aumenta l'amplitú de les vibraciones de la molécula, enerxía que ye finalmente estenada cuando la molécula topeta con otres molécules venciéndola en forma de calor.

L'electrón puede dir cayendo como nuna escalera ente distintos estaos vibracionales venciendo en cada pasu parte de la so enerxía en forma de calor, qu'aumenta les vibraciones de la molécula. Tamién puede faelo dexando toa'l so enerxía de golpe, cayendo a un nivel inferior y emitiendo gran parte de la enerxía en forma d'un únicu cuanto de lluz (situación representada pola primer flecha verde vertical).

Anque en teoría sería posible que l'electrón cayera dende l'estáu vibracional alto al estáu basal S₀, na práutica esto nun asocede, pos la molécula rápido tresfier parte de la enerxía absorbida a otros orbitales per mediu d'un mecanismu de reconversión enerxética interna, un procesu qu'asocede usualmente en tiempos bien curtios del orde de 10^-15 segundos, polo que resulta virtualmente imposible pal electrón vencer nuevamente'l total de la enerxía que recibió y de resultes la lluz emitida ye siempres de menor enerxía y mayor llonxitú d'onda que la recibida. A midida que el tiempu enllargar, mayor ye la cantidá d'enerxía que se pierde por procesos non radiativos y mayor ye'l llonxitú d'onda de la lluz emitida. Eventualmente tolos electrones n'estaos escitaos cayen hasta l'estáu basal yá seya emitiendo lluz (FE) o perdiendo enerxía por procesos non radiativos (NR) estos procesos producir na fluorescencia en tiempos d'hasta 10^-9 segundos.

En delles molécules sicasí, esisten orbitales dexeneraos con enerxíes bien similares a les de los niveles escitaos. Nestes molécules puede asoceder qu'un electrón con alta enerxía dexe parte de la so enerxía a un electrón n'estáu basal pa formar dos electrones desapareados en dos orbitales dexeneraos (tao triplete) d'enerxía entemedia. El tao triplete ye metaestable y puede esistir por tiempos descomanadamente llargos si comparar coles transiciones ente estaos dobletes; nel primer casu los tiempos d'escayencia usualmente van dende les centésimes de segundu hasta les hores. Cuando los electrones en tao triplete aparien los sos espines dexen esa enerxía d'apareyamientu en forma de lluz, produciendo'l fenómenu de fosforescencia.

La relaxación d'un estáu S₁ tamién puede asoceder al traviés d'una interacción con una segunda molécula por aciu lo que se conoz como desactivación (quenching fluorescente) de la fluorescencia, nesti casu la molécula escitada dexa'l so enerxía a otra y esta postrera estenar en forma de calor. El osíxenu molecular (O₂), por casu, ye bien eficiente desactivando la fluorescencia d'otres molécules por cuenta de la so inusual tao triplete fundamental.

Finalmente delles molécules que s'esciten al traviés de l'absorción de lluz o per mediu d'un procesu distintu (P. ex. por causa de una reacción química) pueden tresferir esta enerxía a una segunda molécula 'sensibilizada' por un mecanismu de camín intersistema ente molécules. Al traviés d'esti mecanismu la segunda molécula ye conducida a un estáu d'escitación electrónica y ye finalmente esta postrera la que va emitir fluorescencia. Nestos casos les diferencies d'enerxía ente la radiación excitadora y l'emitida son escepcionalmente grandes. Esti mecanismu utilízase por casu nos contadores de centelleo líquidos pa producir lluz visible a partir de radiaciones nucleares d'alta enerxía.

Fotoquímica

En resume la fluorescencia asocede cuando una molécula, átomu o nanoestructura vuelve al so estáu fundamental dempués de ser escitada electrónicamente.

Escitación:

${\displaystyle S_{0}+h\nu _{ex}\to S_{1}}$

Fluorescencia (emisión) :

${\displaystyle S_{1}\to S_{0}+h\nu _{em}}$

Equí, ${\displaystyle h\nu }$ ye un términu xenéricu pa la enerxía del fotón con h = constante de Planck y onde ${\displaystyle \nu }$ = frecuencia de la lluz. (Les frecuencies específiques de la lluz excitadora y emitida son dependientes en cada sistema en particular.)

L'estáu S₀ llámase estáu fundamental de la molécula fluorescente y S₁ ye'l so primer estáu electrónicu escitáu.

Amás d'estos estaos electrónicos, que correspuenden al allugamientu de los electrones d'enllaz de la molécula en distintes orbitales moleculares, esisten distintos estaos vibracionales pa estos orbitales moleculares, estos estaos vibracionales correspuenden a les oscilaciones qu'esperimenten los átomos que formen la molécula en redol a los enllaces.

Los estaos vibracionales altos pueden estenar enerxía en forma de calor, aumentando les vibraciones de les molécules vecines.

Una molécula n'estáu d'escitación electrónica, S₁, puede adquirir un estáu de menor enerxía por distintos mecanismos. Puede por casu sufrir un 'escayencia non radiativo' nel cual la mayor parte de la enerxía d'escitación ye estenada como calor (vibraciones) escontra'l disolvente. Les molécules orgániques escitaes tamién pueden relaxase por aciu conversión a un tao triplete apurriendo enerxía a otru orbital molecular pa llograr a la fin dos orbitales con enerxíes entemedies, finalmente dalgunu d'estos orbitales reláxase emitiendo un cuanto de lluz, por fosforescencia o por aciu un segundu pasu non radiativo d'escayencia.

Rendimientu cuánticu

El rendimientu cuánticu d'un procesu de fluorescencia ye una manera d'interpretar la eficacia del mecanismu.^[12] (Vease eficiencia cuántica)

Defínese como la proporción ente'l númberu de fotones emitíos y el de fotones absorbíos.

${\displaystyle \Phi ={\frac {\rm {\#\ moleculas\ luminiscentes}}{\rm {\#\ moleculas\ exitacidas}}}}$

El máximu rendimientu cuánticu de fluorescencia ye polo tanto 1 (100%); esto significa que cada fotón absorbíu resulta nun fotón emitíu. Sicasí compuestos con rendimientos cuánticos de 0,10 considérense entá abondo fluorescentes.

Otra forma de definir el rendimientu cuánticu d'un mecanismu de fluorescencia ye por aciu les tases a les cualos aparra l'estáu d'escitación:

${\displaystyle {\frac {{k}_{f}}{\sum _{i}{k}_{i}}}}$

onde ${\displaystyle {k}_{f}}$ ye la tasa d'emisión bonal de radiación y ${\displaystyle \sum _{i}{k}_{i}}$ ye la suma de toles tases d'escayencia.

Otres tases d'escayencia del estáu d'escitación deber a mecanismos distintos a la emisión de fotones y con frecuencia llámense, poro, “tases non-radiativas”.

Ente estes postreres podemos incluyir: desactivación per choque dinámica, interacción de campu cercano dipolo-dipolo (o tresferencia d'enerxía de resonancia), conversión interna y pasu de intersistema. Poro, si la tasa d'escayencia de cualquier vía camuda, esto afecta tantu a la de vida del estáu escitáu, como al rendimientu cuánticu de la fluorescencia.

El rendimientu cuánticu de fluorescencia mídese comparéndolo con un patrón; el sal sulfatu de quinina eslleida n'ácidu sulfúrico ye un patrón común pa la midida de fluorescencia.

Tiempu de vida

El tiempu de vida de la fluorescencia depende básicamente del tiempu permediu que permanez la molécula nel so estáu d'excitación antes d'emitir un fotón.

La fluorescencia típicamente sigue una cinética de primer orde:

${\displaystyle \left[S1\right]=\left[S1\right]_{0}y^{-\Gamma t},}$

onde ${\displaystyle \left[S1\right]}$ ye la concentración de molécules n'estáu d'escitación nel tiempu ${\displaystyle t}$, ${\displaystyle \left[S1\right]_{0}}$ ye la concentración inicial y ${\displaystyle \Gamma }$ ye la tasa d'escayencia o l'inversu del tiempu de vida de la fluorescencia.

Este ye un exemplu d'escayencia esponencial. Dellos procesos radiativos y non radiativos pueden despoblar l'estáu escitáu. Nesi casu, la tasa d'escayencia total ye la suma de toles tases:

${\displaystyle \Gamma _{tot}=\Gamma _{rad}+\Gamma _{nrad}}$

onde ${\displaystyle \Gamma _{tot}}$ ye la tasa d'escayencia global, ${\displaystyle \Gamma _{rad}}$ ye la tasa d'escayencia radiativo y ${\displaystyle \Gamma _{nrad}}$ la tasa d'escayencia non radiativo.

La ecuación ye bien similar a una reacción química de primer orde na cual la tasa constante de primer orde ye la suma de toles tases (un modelu cinéticu paralelu). Si la tasa d'emisión bonal, o cualesquier de les otres tases, son rápides el tiempu de vida ye curtiu.

Pa compuestos fluorescentes qu'emitan fotones con enerxíes dende'l UV hasta l'infrarroxu cercanu, los tiempos típicos d'escayencia del estáu escitáu atopar ente 0.5 a 20 nanosegundos. El tiempu de vida d'un fluoróforo ye un parámetru importante pa les aplicaciones práutiques de la fluorescencia tales como la tresferencia d'enerxía de resonancia.

Llume

Pintura y plásticu fluorescente allumaos por lluz Ultravioleta. (artista: Beo Beyond)

El común tubu fluorescente depende de la fluorescencia. Dientro del tubu de vidriu hai un vacíu parcial y una pequeña cantidá de mercuriu. Una descarga llétrica nel tubu causa que los átomos de mercuriu emitan lluz. La lluz emitida atopar nel rangu ultravioleta (UV), y ye polo tanto invisible pa los nuesos güeyos; pero'l tubu atópase revistíu con una capa d'un material fluorescente llamáu fósforu, que absuerbe la lluz ultravioleta y la reemite nel espectru visible. El llume fluorescente ye energéticamente muncho más eficiente que la teunoloxía incandescente, pero'l espectru producíu puede faer que ciertu colores nun paezan naturales, esto ye asina porque l'espectru d'emisión nun ye continuu, sinón que s'atopa formáu por un llindáu númberu de llonxitúes d'onda (llinies d'emisión).

A mediaos de los años 1990, yá yera teunoloxía común el LED de lluz blanco, esti tipu de LED funciona al traviés d'un procesu similar. Típicamente, nestos dispositivos el semiconductor emisor produz lluz na parte azul del espectru, que topeta con un compuestu fluorescente depositáu nel chip; y esti fluorescente emite na rexón verde y colorao del espectru. La combinación de la lluz azul que pasa al traviés del fluorescente y la lluz emitida pol mesmu produz una lluz cuasi blanco.

La Llámpara fluorescente compacta (CFL) funciona de la mesma forma que cualquier tubu fluorescente típica y con ventayes. Ye utilizada pa reemplazar llámpares incandescentes en munches aplicaciones. Producen un cuartu del calor por lumen emitíu que los bombillos incandescentes y duren hasta cinco veces más. Estes llámpares contienen mercuriu y tienen de ser remanaes y dispuestes con cuidu. Les desventaxes de qu'estes llámpares tengan un balastru ye que nun encaxar afechiscamente en tolos aparatos de lluz. Toles llámpares fluorescentes tienen un retrasu significativu al momentu de ser encendíes comparaes coles llámpares incandescentes, una desventaxa en delles aplicaciones. Adicionalmente, la teunoloxía que-yos dexa ser usaes tamién amenorga significativamente la so vida útil y la so fiabilidá n'aplicaciones de lluz crepuscular, por casu al utilizales colos famosos atenuadores o dimmers.

Química analítica

La fluorescencia puede ser detectada con un monocromador p'atopar emisiones típiques de compuestos presentes nuna cromatografía líquida d'alta eficacia. Amás, dexa visualizar les manches producíes por una TLC si los compuestos o los reactivos de reveladores son fluorescentes.

La fluorescencia ye más efectiva cuando hai una gran proporción d'átomos nos niveles baxos d'enerxía nuna distribución de Boltzmann. Esiste entós una mayor probabilidá que los átomos con enerxía baxa sían escitaos y lliberen de la mesma fotones, dexando asina un analís más eficiente.

Les buelgues dactilares pueden visualizase con compuestos fluorescentes como la ninhidrina.

Bioquímica y medicina

Les biomoléculas pueden marcase con un grupu químicu fluorescente (fluorocromo) por aciu una reacción química simple, lo cual dexa una detección sensible y cuantitativo de la molécula. Dellos exemplos:

• La microscopía de fluorescencia de texíos, célules o estructures subcelulares consíguese marcando l'anticuerpu con un fluorocromo y dexando qu'aquél atope'l so antígeno correspondiente presente na muestra. Al marcar dellos anticuerpos con distintos fluorocromos puede llograse la visualización de múltiples oxetivos dientro d'una mesma imaxe.
• Secuenciación automática d'ADN pol métodu de terminación de la cadena: cada unu de los cuatro ddNTP atópase marcáu con un fluorocromo específicu, de tala forma que xenérense cadenes de distintu llargor que al ser sometíes a una fonte de UV puede determinase la base nitrogenada terminal de cada cadena por cuenta del llonxitú d'onda emitida carauterística de cada fluorocromo.

Electroforesis en xel de agarosa tiñíu con bromuru de etidio. El bromuru de etidio entrepolar nel ADN y fluoresce naranxa cuando s'espón a lluz UV.

• Detección d'ADN: el compuestu bromuru de etidio, llibre de camudar la so conformanza en disolución, tien poca fluorescencia. La fluorescencia del bromuru de etidio auméntase descomanadamente cuando se xune al ADN, de tala forma que esti compuestu ye bien útil pa visualizar la llocalización de fragmentos d'ADN nel métodu d'electroforesis en xeles de agarosa. El bromuru de etidio puede ser tóxicu, por tanto una alternativa más segura ye tiñir con SYBR Green.
• Microarreglos
• Inmunoloxía: los sitios d'unión d'un anticuerpu a un espécime microscópicu por casu, pueden ser vistos, ya inclusive cuantificados, emplegando la fluorescencia si xunióse-y primeramente un grupu químicu fluorescente al anticuerpu específicu (IFI).
• La fluorescencia foi emplegada pal estudiu de la estructura y conformanza del ADN, asina mesmu como de proteínes, con téuniques como la tresferencia d'enerxía de resonancia, que mide distancies a nivel de angstroms. Lo anterior ye especialmente importante en complexos de biomoléculas múltiples.
• Ye utilizada en (Citometría) de fluxu pa identificar distintos receptores nes célules estudiaes, marcando estes célules con anticuerpos específicos conxugaos a un fluorescente.
• La Proteína Verde Fluorescente (GFP), de l'aguamala Aequorea victoria, convirtióse nuna ferramienta d'investigación bien importante. GFP y otres proteínes rellacionaes son usaes como reporteros d'un ensin númberu d'eventos biolóxicos incluyendo aquellos de llocalización subcelular. Los niveles d'espresión xénica son midíos en delles ocasiones xuniendo'l xen de producción de GFP col xen d'interés.

Tamién, diverses molécules biolóxiques tienen fluorescencia intrínseca y por tanto, pueden ser emplegaes ensin necesidá de xuniles a una etiqueta química. Delles vegaes, esta fluorescencia intrínseca camuda cuando la molécula atopar nun ambiente específico, de tala forma que la distribución o'l lligamientu de la molécula pueden ser midíos. La bilirrubina, por casu, ye altamente fluorescente cuando se xune a l'albúmina sérica nun sitiu específicu. La protoporfirina cinc, que s'atopa nes célules sanguínees cuando la producción del grupu hemo ye tornáu pola esistencia de plomu o l'ausencia de fierro nel sangre, tien una fuerte fluorescencia y puede ser, por tanto, emplegada pa detectar estos problemes.

El númberu d'aplicaciones de la fluorescencia foi creciendo nel campu de la biomedicina, la bioloxía y n'otres ciencies rellacionaes. Los métodos d'analises nestos campos tamién fueron aumentando: FPIA, FLIM, FLI, FLIP, CALI, FLIE, FRET, FRAP, FCS, PFRAP, smFRET, FRIPS, SHRIMP o TIRF. Munches d'estes téuniques basar nos microscopios de fluorescencia. Los microscopios utilicen fontes de lluz d'alta intensidá, usualmente llámpares de mercuriu o xenón, LED's, o láseres, pa xenerar fluorescencia nes muestres so observación. Darréu, los filtros ópticos dixebren la lluz escitada de la fluorescencia emitida, pa dexar que seya detectada a güeyu, emplegando una cámara o utilizando dalgún otru detector de lluz como espectrógrafos, etc. Munches investigaciones tán llevándose a cabu p'ameyorar yá seya los desempeñu d'estos microscopios, les sondes fluorescentes usaes, y les aplicaciones de les mesmes. D'interés particular son los microscopios confocales, que utilicen un poru pa llograr seiciones óptiques, apurriendo una vista cuantitativa y en 3D de la muestra.

Xemoloxía, mineraloxía, xeoloxía y ciencies forenses

Les xemes, los minerales, les fibres y munchos otros materiales que pueden ser atopaos en medicina forense, pueden tener una fluorescencia distintiva o pueden fluorecer distinta baxu lluz ultravioleta d'onda curtia, d'onda llarga, o rayos X: Munchos tipos de calcita y ámbare van presentar fluorescencia so lluz ultravioleta d'onda curtia. Los rubinos, les esmeraldes y el diamante Hope exhiben fluorescencia colorada so lluz UV d'onda curtia; los diamantes tamién emiten lluz so rayos X.

El petroleu emite fluorescencia nun rangu de colores, dende'l marrón mate p'aceites pesaos y alquitrán hasta l'amarellentáu y blancu azuláu pa los aceites bien llixeros y entestaos. Esti fenómenu ye usáu en perforaciones feches pa la esploración de petroleu dexando identificar pequeñes cantidaes de crudu nes perforaciones y nos poros de les muestres.

Líquidos orgánicos

Los líquidos orgánicos, como los amiestos d'antraceno en bencenu o tolueno, emiten fluorescencia so l'acción de radiación UV o rayu gamma. Los tiempos d'escayencia d'esta fluorescencia atopar nel orde de los nanosegundos una y bones la duración de la lluz depende del tiempu de vida de los estaos escitaos del material fluorescente, nesti casu antraceno.