Variaciones del llargor del apanfilo VNTR en seis individuos.

La buelga xenética (tamién llamada prueba d'ADN o analís d'ADN) ye una téunica que s'utiliza pa estremar ente los individuos d'una mesma especie utilizando muestres de la so ADN. La so invención deber al doctor Alec Jeffreys, de la Universidá de Leicester, quien dio a conocer la so nueva téunica en 1984.[1] La primer resultancia práutica en medicina forense sirvió pa condergar a Colin Pitchfork polos asesinatos de Narborough en 1983 y de Enderby en 1986.[2]

La téunica basar en que dos seres humanos tienen una gran parte de la so secuencia d'ADN de mancomún y p'estremar a dos individuos puede esplotase la repetición de secuencies altamente variables llamaes minisatelites o VNTR. Dos seres humanos ensin rellacionar va ser pocu probable que tengan el mesmu númberu de minisatélites nun determináu locus. Nel SSR/STR de perfiles (que ye distintu de calquier xenéticu) la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizar pa llograr abondu ADN que dexe detectar el númberu de repeticiones en dellos loci. Ye posible establecer una seleición que ye bien pocu probable que surdiera por casualidá, salvu nel casu de ximielgos idénticos, que van tener idénticos perfiles xenéticos.

La buelga xenética utilizar na medicina forense pa identificar a los sospechosos con muestres de sangre, pelo, cuspia o semen. Tamién dio llugar a delles exoneraciones de condergaos. Igualmente utilízase n'aplicaciones como la identificación de los restos humanos, les pruebes de paternidá, la compatibilidá na donación d'órganos, l'estudiu de les poblaciones d'animales monteses, y l'establecimientu del orixe o la composición d'alimentos. Tamién s'utilizó pa xenerar hipótesis sobre les migraciones de los seres humanos na prehistoria.

Los microsatélites amuesen una mayor variación que'l restu del xenoma yá que nellos atopen unes secuencies en distinta repetición y con distintu grau de recombinación por cuenta de la inestabilidá del locus.

Muestres de referencia

Pa la identificación del ADN tien de realizase una estracción d'ADN que puede venir de muestres tales como:

  • Artículos personales (por casu cepiyu de dientes, máquina d'afaitar).
  • Bancu de muestres (como un bancu de semen o la biopsia d'un texíu).
  • Parientes.
  • Restos humanos primeramente identificaos.

Delles muestres de referencia recoyer con un hisopu bucal.

Téuniques d'identificación de la "buelga xenética"

Estes variaciones pueden detectase coles siguientes téuniques:

Analís de RFLP

L'analís consiste en faer un ensayu Southern (o Southern blot, un métodu que sirve pa verificar si una determinada secuencia d'ADN ta o non presente nuna muestra d'ADN analizada) y usar sondes específiques pa detectar los VNTR (númberu variable de repeticiones en tándem).

En primer llugar l'ADN que se va a analizar dixebrar d'otros materiales. De siguío, tien de cortase en fragmentos de distintos tamaños usando enzimes de restricción, que son proteínes que corten l'ADN ensin estropiar les bases. Los fragmentos ordenar por tamañu emplegando la electroforesis en xel. L'ADN, que tien carga negativa, avanza nel campu llétrico. Les molécules más pequeñes muévense más rápido al traviés del xel, polo que se van alcontrar más alloñaes del orixe que los fragmentos más grandes. Depués por calor o solución alcalina, aplícase xel col fin de desnaturalizar l'ADN y dixébrase en fragmentos individuales. Una vegada realizáu esto l'ADN esta agora llistu pa ser analizaos utilizando una sonda radiactiva de reacción d'hibridación.

Pa faer la sonda radiactiva, precísase la polimerasa del ADN. L'ADN que se va someter a la radioactividá asitiar nun tubu d'ensayu. De siguío amiéstase la polimerasa nel tubu. Eslleir y espérase a qu'empiece a funcionar. Como los parches de polimerasa d'ADN ruempen l'ADN, los actuales son sustituyíos polos nuevos nucleótidos nel tubu. Cada vez que la muestra tenga una base guanina, la citosina va ser puestu en radioactividá. Na repetición del ADN, la polimerasa tamién se vuelve radioactiva. Les pieces radioactives tán llistes pal so usu. Agora la sonda radioactiva pue ser usada pa crear una reacción d'hibridación. La hibridación asocede cuando dos secuencies xenétiques xúnense pola mor del hidróxenu que s'atopa nos pares de les bases. Hai dos d'estos ente adenina (A) o timina (T) y trés de citosina (C) o guanina (G). Pa realizar la hibridación l'ADN tien que tar desnaturalizado.

L'ADN desnaturalizado radioactivu y la sonda tienen de ser puestos nuna bolsa de plásticu con líquidu salino y selláu fuertemente. La sonda va xuntar a la desnaturalización d'ADN uquier que s'atope de forma apropiada. La sonda y l'ADN nun tienen qu'encaxar de forma exacta. Esti procesu termina faciendo un patrón d'ADN de les buelgues dixitales. Toa persona tien un VNTR qu'heredó d'unu de los sos padres y los VNTR son únicos pa cada persona.

Analís por PCR

Consiste en aplicár la téunica de PCR p'amplificar rexones específiques colos cebadores fayadizos. Cola invención de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) la teunoloxía xenética tuvo una importante meyora na capacidá de recuperación d'información a partir de muestres bien pequeñes. PCR consiste na amplificación de rexones específiques d'ADN usando temperatura y una enzima polimerasa termoestable xunto con fluorescencia etiquetada nuna secuencia específica del ADN. Esisten kits comerciales qu'utilicen polimorfismos de nucleotidu únicu (SNP) de discriminación disponible, estos kits d'usu de PCR usaos p'amplificar rexones específiques con variaciones conocíes ya hibridación con sondes de fondiáu en tarxetes, lo que resulta nuna mancha de color correspondiente a una orde en particular.

Les principales crítiques al métodu RFLP inciden na so lentitú y nes grandes cantidaes d'ADN que rique pa llograr resultaos útiles. Esto llevó a métodos basaos en PCR que riquen menores cantidaes d'ADN que pueden ser tamién más degradaos que los utilizaos n'analises de RFLP.

Los ensayos de PCR son desaxeradamente pervalibles pa identificár nuevos miembros d'una familia xénica.

AmpFLP

Trátase d'una téunica d'amplificación de rexones polimórficas (con munchos polimorfismos [6]), preferiblemente el locus D1S80. Esti analís pueden ser automatizado, y dexa la fácil creación d'árboles filoxenéticos basaos na comparanza de les muestres individuales d'ADN.

Basáu nel númberu variable de repeticiones en tándem (VTNR) pa estremar diversos polimorfismos alelos, que son dixebraos nun xel de poliacrilamida utilizáu nuna escalera alélica (n'oposición a un pesu molecular). Bandes podríen ser visualizaos por tincíon de xel de plata. Un llugar popular para tomar de buelgues dactilares ye'l locus D1S80. Al igual que los métodos basaos en PCR, l'ADN degradáu o en cantidaes bien pequeñes d'ADN puede causar alélica d'abandonu.

Por cuenta del so costu relativamente baxu y la facilidá pa la so puesta en marcha y operación, AmpFLP sigue siendo popular nos países de baxos ingresos.

Analís STR (Short Tandem Repeat)[3]

Consiste na amplificación de secuencies con pequeñes repeticiones en tándem que nun se caltienen dientro de la especie. Una vegada amplificaes dixébrense los fragmentos pa comprobar el númberu de repeticiones (por aciu electroforesis capilar o en xel), de forma que pueden estremase patrones de repeticiones que pueden ser comparables y asociables.

Esti métodu usa rexones altamente polimórficas que tienen secuencies curties repitíes d'ADN (el más común ye de 4 bases repitíes, pero hai otros llargores n'usu, incluyendo bases 3 y 5). Porque distintes persones tienen distintos númberos d'unidaes de repetición y estes rexones de la DNA puede utilizase pa estremar ente les persones. Estos STR loci (llugares) son atacaos con primers específicos de secuencia y amplifíquense por aciu PCR. Los fragmentos d'ADN que son resultáu entós detectaos y separaos por aciu electroforesis. Esisten dos métodos de separación y detección, la electroforesis capilar (CE) y la electroforesis en xel.

Los polimorfismos STR amosaos en cada rexón son de por sí bien comunes, polo xeneral, cada polimorfismu ye compartida per alredor d'un 5 - 20% de les persones. Cuando reparamos múltiples loci, ye la única combinación d'estos polimorfismos d'un individuu que fai qu'esti métodu de discriminación seya un preséu d'identificación. Les rexones STR que se ponen a prueba nuna persona convertir nuna discriminación de la prueba.

D'un país a otru esisten distintos sistemes STR nel analís d'ADN que tán n'usu. N'América del Norte los sistemes qu'amplifiquen el CODIS 13 loci nucleu son cuasi universal, ente que nel Reinu Xuníu, el sistema de SGM +, que ye compatible cola base de datos nacional d'ADN esta n'usu. Sía'l que quier el sistema utilizáu, munches de les rexones STR usaes na prueba son los mesmes. Estos sistemes d'analises d'ADN básense en redol a les reacciones múltiplex, que munches rexones STR va ser sometíu a prueba nel mesmu tiempu.

Estructura del ADN.

La electroforesis capilar (movimientu por aciu l'aplicación d'un campu llétrico), dexa la inyeición de fragmentos d'ADN nun tubu de vidriu delgáu (capilar) llena de polímeros. L'ADN ye estrayíu al traviés del tubu pola aplicación d'un campu llétrico, la separación de los fragmentos asocede de tal manera que los más pequeños fragmentos de viaxen más rápidu al traviés de los capilares. Los fragmentos son entós detectaos utilizando colorantes fluorescentes que s'axunta a los primers utilizaos na PCR. Esto dexa que múltiples fragmentos amplificaos executar de manera simultánea, daqué conocíu como multiplexación. Depués asígnense talles utilizando'l tamañu del ADN como normes d'etiquetáu que s'añedir a cada muestra, y el númberu de repeticiones determinar comparando'l tamañu de la escalera alélica, que contién una muestra de tolos tamaños comunes de les posible repeticiones. Anque esti métodu ye costosu, con mayor capacidá de les máquines y un mayor rendimientu de les que se tán utilizando p'amenorgar el costu/muestra ye posible amenorgar los retrasos qu'esisten en munches instalaciones de la delincuencia gobierno.

Electroforesis en xel ye unu de los actos que ye utilizáu usando principios similares conocíos como "CE", pero en llugar d'utilizar un capilar, el gran xel de poliacrilamida utilizar pa dixebrar los fragmentos d'ADN. Un campu llétrico ye aplicáu, como na CE, pero en llugar de correr toles muestres por un detector, los fragmentos más pequeños execútense cerca de la parte inferior del xel y tol xel ye escaniáu y guardáu nun ordenador. Esto produz una imaxe que muestra tolos de les bandes correspondientes a distintos tamaños y repite la escalera alélica. Esti métodu nun riquir l'usu de les normes de tamañu, una y bones la escalera alélica execútase xunto coles muestres y sirve pa esti propósitu. La visualización puede ser al traviés del usu de marcaos tintes fluorescentes primers na tinción de plata o pol xel antes d'escaniar. A pesar de que ye rentable y puede ser de bastante altu rendimientu, p'aplicar la tinción de plata ITS suspéndese. Amás, munchos llaboratorios tán eliminación gradualmente xeles a favor de la CE, faciendo'l costu de les máquines fáigase más afechisca.

El verdaderu poder del analís STR atopar nel poder estadístico de la discriminación. Nos EE.XX., hai 13 centrales loci (llugares d'ADN) que s'utilicen anguaño pa la discriminación nel CODIS. Por cuenta de que estos llugares usen una variedá de forma independiente (con un determináu númberu de repeticiones nun locus nun camuda la probabilidá de tener cualquier númberu de repeticiones en cualesquier otru llugar), el productu de la regla de probabilidaes pueden aplicase. Esto significa que si daquién tien l'ADN de tipu ABC, nel que los trés loci son independientes, podemos dicir que la probabilidá de qu'esi tipu d'ADN ye la probabilidá de tener tipu Dacuando la probabilidá de tener el tipu B vegaes ye la probabilidá de tener el tipu de C. El métodu de mayor prevalencia d'ADN de les buelgues dactilares utilizaos anguaño ta basáu na PCR y utiliza curtiu repite tándem (STR). Esti métodu usa rexones altamente polimórficas que repitieron secuencies curties d'ADN (el más común ye de 4 bases repitíes, pero hai otros llargores n'usu, incluyendo bases 3 y 5). Porque distintes persones tienen distintos númberos d'unidaes de repetición, estes rexones de la DNA puede utilizase pa discriminar ente les persones. Estos STR loci (llugares) son atacaos con primers específicos de secuencia y amplifíquense por aciu PCR. Los fragmentos d'ADN que son resultáu entós detectaos y separaos por aciu electroforesis. Esisten dos métodos de separación y detección, la electroforesis capilar (CE) y la electroforesis en xel.

Los polimorfismos STR amosaes en cada rexón son de por sí bien común, polo xeneral, cada polimorfismu va ser compartíu per alredor d'un 5 - 20% de les persones. Cuando reparamos múltiples loci, la única combinaciones d'estos polimorfismos d'un individuu fai qu'esti métodu de la discriminación seya un preséu d'identificación. Les demás rexones STR que se ponen a prueba nuna persona convertir nuna discriminación de la prueba.

Analís del cromosoma Y

Creáronse cebadores específicos pa rexones del cromosoma Y que amplifiquen secuencies solo heredaes per parte paterna. Por ello, esti tipu d'analís namái sirve pa comparar familiares per parte del padre y varones.

Analís mitocondrial

Usar en muestres bien degradaes, una y bones el DNA mitocondrial tien más copies que'l nuclear. Amplifíquense les rexones HV1 y HV2 y compárense siempres con familiares per parte materna una y bones les mitocondrias son heriedu esclusivu de la madre. Los científicos forenses amplíen la rexón HV1 y HV2 del ADNmt y depués cada rexón ye secuenciada nun únicu nucleótido y compárase les diferencies cola referencia.

Aplicaciones práutiques de la buelga xenética

  • Ciencia forense. Comparar sospechosos con muestres de sangre, pelo, cuspia o semen debitadas.
  • Identificación de restos humanos por comparanza con muestres de familiares.
  • Pruebes de Paternidá
  • Estudiar la compatibilidá en donaciones d'órganos.
  • Estudios d'evolución de poblaciones animales selvaxes.
  • Estudiu de la composición de los alimentos.
  • Xeneración d'hipótesis sobre les migraciones humanes na hestoria.
  • En neños adoptaos o concebíos por aciu téuniques de reproducción asistida emplegando gametos donaos. Nestos casos los fíos nun comparten el códigu xenéticu colos sos padres, de cuenta que na identificación biolóxica non pueden emplegase los estudios d'ADN per comparanza con el proxenitores.

Exemplos d'usu de la buelga xenética”

El primer casu en que s'utilizó esta téunica foi nun casu d'inmigración al Reinu Xuníu. Trátase d'un mozu orixinariu de Ghana al que, al volver d'un viaxe al so país, negóse-y la residencia porque la so documentación paecía falsificada. Les pruebes d'ADN demostraron con un 99,997% de probabilidá, que yera hermanu de los demás fíos de la so madre, de nacionalidá británica, polo que pudo quedase nel Reinu Xuníu.

Otru casu, de los primeros casos de repercusión internacional, foi'l de Josef Mengele, criminal de guerra nazi, que los sos supuestos restos fueron afayaos en 1985 nun campusantu brasilanu. En 1988 comparóse l'ADN estrayíu d'un güesu de la cadarma col ADN del sangre de la esposa y el fíu de Mengele. La conclusión, con un 99,94% de probabilidá foi positiva pa la identificación de los restos atopaos como los pertenecientes a Mengele.

L'aceptación de la buelga xenética como métodu forense, en casos criminales, tardó abondo más. La condena d'una persona sobre esta base foi considerada mientres años demasiáu aventurada, a pesar de que la so comparanza con otros métodos menos precisos, como la identificación visual, beneficiába-y. Sicasí, el perfeccionamiento y la normalización del métodu llevaron a la so aceptación universal. En casos recién, haise exonerado a persones condergaes inclusive a cadena perpetua y a la pena de muerte nel so momentu, sobre la base del so ADN. El primer casu foi'l del estauxunidense Kirk Bloodsworth, condergáu a la pena de muerte en 1985 pol asesinatu y violación d'una neña de nueve años. La revisión del casu producir en 1992 cola resultancia de que Bloodsworth quedó en llibertá en 1993.


Animación del ADN.

Unu de los casos más famosos d'aplicación de la buelga xenética foi la Oveya Dolly, presentada en 1997 como'l primer mamíferu clonáu d'una célula adulta. Esta afirmación non pudo sostenese científicamente hasta que se realizó la comprobación de que'l so ADN yera idénticu al de la oveya donante. Foi l'equipu de Jeffreys el que probó "más allá de cualquier dulda razonable que Dolly vien de una célula del texíu mamario tomada de la oveya adulta donante", esplicó entós Esther Signer, autora del analís.

En determinaos países esti tipu de pruebes son voluntaries salvu en casu d'orde jurídicial, yá que podríen usase como pruebes determinantes en juicio si asina lo creyera conveniente'l xuez d'un casu.

El siguiente pasu ye'l dadu per dellos países, ente ellos EEXX[4] y O.K.,[5] creando bases de datos colos perfiles xenéticos de munchos de los sos habitantes que los facilitaría'l resolución de casos criminales por comparanza de perfiles.

Na actualidá, Alec J. Jeffreys continua estudiando la téunica de buelga xenética realizando recién estudios. Concretamente, en 2006 publicóse un estudiu onde s'estudiaba cómo una única hebra de DNA puede apurrir información de les recombinaciones ectópicas poniendo de manifiestu les distintes víes de recombinación meiótica nel clúster de la α-globina y el so rellación con derivar de poblaciones.[6] Y darréu, en 2007, publicóse l'estudiu de rexones de los minisatélites altamente polimórficas (VNRT's) nel fluxu xenético al traviés de la evolución de mures. [7]

Referencies


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