تسلسل البروتين

تتم عملية التحلل المائي عن طريق تسخين عينة من البروتين في حمض الهيدروكلوريك M 6 إلى 100-110 درجة مئوية لمدة 24 ساعة أو أكثر. قد تتطلب البروتينات التي تحتوي على العديد من مجموعات الهيدروفوبية الضخمة فترات تسخين أطول. ومع ذلك، فإن هذه الظروف قوية للغاية لدرجة أن بعض الأحماض الأمينية (سيرين، ثريونين، تيروزين، تريبتوفان، جلوتامين، وسيستين) متدهورة. للتحايل على هذه المشكلة، يقترح Biochemistry Online تسخين عينات منفصلة لأوقات مختلفة، وتحليل كل حل ناتج، واستقراء إلى وقت عدم التحلل. يقترح راستول مجموعة متنوعة من الكواشف لمنع أو الحد من التدهور، مثل الكواشف ثيول أو الفينول لحماية التربتوفان والتيروزين من هجوم الكلور، وقبل السيستين. كما يقترح أيضًا قياس كمية الأمونيا المتطورة لتحديد مدى تحلل الأميد.

يمكن فصل الأحماض الأمينية عن طريق كروماتوغرافيا التبادل الأيوني ثم اشتقاقها لتسهيل اكتشافها. أكثر شيوعا، يتم اشتقاق الأحماض الأمينية ثم حلها عن طريق مرحلة عكسية HPLC.

يتم إعطاء مثال على اللوني التبادل الأيوني من قبل NTRC باستخدام polycyated polystyrene كمصفوفة، مضيفا الأحماض الأمينية في المحاليل الحمضية ويمر حاجز من زيادة درجة الحموضة بشكل مطرد من خلال العمود. تتم إزالة الأحماض الأمينية عندما يصل الرقم الهيدروجيني إلى نقاط كهروضوئية كل منها. بمجرد فصل الأحماض الأمينية، يتم تحديد الكميات الخاصة بها بإضافة كاشف سيشكل مشتقًا ملونًا. إذا كانت كميات الأحماض الأمينية تزيد على 10 نانومول، يمكن استخدام النينهيدرين لذلك ؛ يعطي لونًا أصفرًا عندما يتفاعل مع البرولين، والأرجواني الزهري مع الأحماض الأمينية الأخرى. تركيز الأحماض الأمينية يتناسب مع امتصاص المحلول الناتج. مع كميات صغيرة جدا، وصولا إلى 10 pmol ، يمكن تشكيل مشتقات الفلورسنت باستخدام الكواشف مثل (OPA)أو fluorescamine.

قد يستخدم اشتقاق العمود قبل استخدام كاشف Edman لإنتاج مشتق تم اكتشافه بواسطة ضوء UV. تتحقق حساسية أكبر باستخدام كاشف يولد مشتق الفلورسنت. تخضع الأحماض الأمينية المشتقة لكروماتوجراف طور معكوس، وعادة ما تستخدم عمود سيليكا C8 أو C18 وتدرج شطف محسن. يتم الكشف عن الأحماض الأمينية المستحدثة باستخدام كاشف للأشعة فوق البنفسجية أو الفلورية ومناطق الذروة بالمقارنة مع تلك الخاصة بالمعايير المشتقة من أجل تحديد كل حمض أميني في العينة.

الببتيدات أطول من حوالي 50-70 من الأحماض الأمينية الطويلة لا يمكن أن تكون متسلسلة بشكل موثوق به بواسطة تدهور إدمان. وبسبب هذا، يجب تقسيم سلاسل البروتين الطويلة إلى شظايا صغيرة يمكن بعد ذلك تسلسلها بشكل فردي. يتم إجراء الهضم إما عن طريق endopeptidases مثل التربسين أو البيبسين أو بواسطة الكواشف الكيميائية مثل بروميد السيانوجين. تعطي الإنزيمات المختلفة أنماط انقسام مختلفة، ويمكن استخدام التراكب بين الشظايا لبناء تسلسل شامل.

يتم كثف الببتيد المتسلسل على سطح صلب. أحد الركائز المشتركة هي الألياف الزجاجية المطلية بـ polybrene ، وهو بوليمر كاتيوني. تمت إضافة كاشف Edman ، phenylisothiocyanate (PITC) ، إلى الببتيد الممتز، إلى جانب محلول عازل أساسي أقل ما يقال من 12٪ تريميثيل أمين. هذا يتفاعل مع مجموعة الأمين من الأحماض الأمينيه N-terminal.

يمكن بعد ذلك فصل الحمض الأميني الطرفي بشكل انتقائي عن طريق إضافة حمض لا مائي. المشتقة ثم الايزوميرات لإعطاء بديل phenylthiohydantoin ، والتي يمكن غسلها وتحديدها بواسطة اللوني، ويمكن تكرار الدورة. تبلغ كفاءة كل خطوة حوالي 98٪، مما يسمح بتحديد 50 حمضًا أمينيًا بشكل موثوق به.

A Beckman-Coulter Porton LF3000G protein sequencing machine

بروتين [3] هو جهاز يقوم بتحليل إدمان بطريقة آلية. يتم تثبيت عينة من البروتين أو الببتيد في وعاء التفاعل لبروتين الترانزستور، ويتم إجراء تدهور إدمان. كل دورة تطلق وتستمد من حمض أميني واحد من البروتين N-terminus أو الببتيد N-terminus ، ومن ثم يتم التعرف على مشتق الأحماض الأمينية الذي تم إصداره بواسطة HPLC. تتم عملية التسلسل بشكل متكرر لعديد الببتيدات بالكامل حتى يتم إنشاء كامل التسلسل القابل للقياس أو لعدد محدد مسبقًا من الدورات.

تم وصف مخطط عام لتحديد البروتين

1. يتم عزل POI ، عادةً بواسطة إس دي إس بايج أو كروماتوغرافي.
2. قد يتم تعديل POI المعزول كيميائياً لتثبيت بقايا السيستين (على سبيل المثال S-amidomethylation أو S-carboxymethylation).
3. يتم هضم POI مع بروتياز معين لتوليد الببتيدات. التربسين ، الذي يشق انتقائيًا على الجانب C-terminal من مخلفات Lysine أو Arginine ، هو الأنزيم الأكثر استخدامًا. وتشمل مزاياه i) تواتر مخلفات Lys و Arg في البروتينات، ii) خصوصية عالية من الإنزيم، iii) استقرار الإنزيم و iv) مدى ملاءمة الببتيدات التريبتية لقياس الطيف الكتلي.
4. قد تكون peptides desalted لإزالة الملوثات المتأينة وتعرض ل MALDI-TOF مطياف الكتلة. قد يوفر القياس المباشر لكتل الببتيدات معلومات كافية لتحديد البروتين (انظر بصمة كتلة الببتيد ولكن غالباً ما يتم استخدام تجزئة الببتيدات داخل مطياف الكتلة للحصول على معلومات حول تتابعات الببتيدات. بدلا من ذلك، قد يتم تحلية الببتيدات وفصلها بواسطة مرحلة عكسية HPLC ويتم إدخالها إلى مطياف الكتلة عبر مصدر تأين بالترذيذ الإلكتروني. قد توفر LC-ESI-MS معلومات أكثر من MALDI-MS للتعرف على البروتين ولكنها تستخدم المزيد من الوقت للأجهزة.
5. اعتمادًا على نوع مطياف الكتلة، قد يحدث تجزئة أيونات الببتيد عبر مجموعة متنوعة من الآليات مثل الانحلال بفعل التصادم (CID) أو Post-source day ‏ ( PSD). في كل حالة، يوفر نمط أيونات الشظايا من الببتيد معلومات حول تسلسلها.
6. ثم يتم مطابقة المعلومات بما في ذلك الكتلة المقاسة من أيونات الببتيد المفترضة وأيونات أيونات الشظايا مقابل قيم الكتلة المحسوبة من التحليل البروتوجرافي (في السيليكو) المفاهيمي وتجزئة قواعد البيانات لتسلسل البروتين. سيتم العثور على تطابق ناجح إذا تجاوزت درجته حدًا استنادًا إلى معلمات التحليل. وحتى إذا لم يكن البروتين الفعلي ممثلاً في قاعدة البيانات، فإن المطابقة للخطأ تسمح بالتعريف المفترض للبروتين على أساس تشابه البروتينات المثالية. تتوفر مجموعة متنوعة من حزم البرامج لإجراء هذا التحليل.
7. تقوم حزم البرامج عادةً بإنشاء تقرير يوضح هوية (رمز الدخول) لكل بروتين محدد، ودرجة تطابقها، وتوفر مقياسًا للقوة النسبية للمطابقة التي يتم فيها تحديد عدة بروتينات.
8. يستخدم الرسم البياني للببتيدات المتطابقة على تسلسل البروتين المحدد لإظهار التغطية التسلسلية (٪ من البروتين المكتشفة بالببتيدات). حيث يعتقد أن POI أصغر بكثير من البروتين المتطابق، قد يشير الرسم البياني إلى ما إذا كانت POI عبارة عن جزء N-or C-terminal من البروتين المحدد

إن نمط تجزئة الببتيد يسمح بالتعريف المباشر لتسلسله بواسطة [تسلسل دي نوفو ببتيد | تسلسل دي نوفو]. ويمكن استخدام هذا التسلسل لمطابقة قواعد بيانات تسلسلات البروتين أو التحقيق في بعد متعدية التعابير أو تعديلات كيميائية. قد يقدم دليلاً إضافياً على توصيف البروتين الذي تم إجراؤه على النحو الوارد أعلاه.

لا تتضمن الببتيدات المتطابقة أثناء تحديد البروتين بالضرورة N- أو C-termini المتوقع للبروتين المتطابق. قد ينتج هذا عن الببتيدات N- أو C- الطرفية التي يصعب تحديدها بواسطة MS (على سبيل المثال إما أن تكون قصيرة جدًا أو طويلة جدًا) ، أو يتم تعديلها بعد الترجمة (على سبيل المثال، acetylation N-terminal) أو اختلافًا حقيقيًا عن التوقع. يمكن تحديد التعديلات بعد الترجمة أو termini المقتطعة عن طريق فحص أكثر دقة للبيانات (أي تسلسل "de novo"). قد يكون من المفيد أيضًا استخدام الخلاصة المتكررة باستخدام بروتياز ذات خصوصية مختلفة

في حين يمكن استخدام المقارنة التفصيلية لبيانات MS مع التنبؤات المستندة إلى تسلسل البروتين المعروف لتحديد التعديلات بعد متعدية، كما يمكن استخدام المناهج المستهدفة للحصول على البيانات. على سبيل المثال، قد يساعد التخصيب النوعي ل phosphopeptides في تحديد مواقع فسفرة في البروتين. يمكن للطرق البديلة لتجزئة الببتيد في مطياف الكتلة، مثل ETD أو ECD ، إعطاء معلومات تسلسل تكميلية.

الكتلة الكاملة للبروتين هي مجموع كتل بقايا الأحماض الأمينية بالإضافة إلى كتلة جزيء الماء ويتم ضبطها لأي تعديلات ما بعد الترجمة. على الرغم من أن البروتينات المؤينة أقل جودة من الببتيدات المشتقة منها، يمكن أن يكون البروتين الموجود في المحلول قابلاً للتعرض لـ ESI-MS وكتلته تقاس بدقة 1 جزء في 20000 أو أفضل. وكثيراً ما يكون ذلك كافياً للتأكيد على termini (وبالتالي أن تطابقات الكتلة المقاسة بالبروتين التي تنبأت من تسلسلها) وتستنتج وجود أو عدم وجود العديد من التعديلات بعد متعدية.

لا ينتج التحلل البروتيني دائمًا مجموعة من الببتيدات القابلة للتحليل بسهولة والتي تغطي كامل تسلسل POI. لا يؤدي تشظّي الببتيدات في مطياف الكتلة إلى أيونات تناظر الانقسام في كل رابطة ببتيدية. وهكذا، فإن التتابع المستنتج لكل ببتيد ليس بالضرورة مكتملًا. لا تفرق الطرق القياسية للتجزئة بين بقايا الليوسين والـ Isoleucine لأنها متساوية.

نظرًا لأن تدهور إدمان يحدث من المحطة N للبروتين، فإنه لن يعمل إذا تم تعديل N- terminus كيميائيًا (على سبيل المثال بواسطة acetylation أو تشكيل حمض Pyroglutamic). تدهور إدمان عموما ليست مفيدة لتحديد مواقف جسور ثاني كبريتيد. كما يتطلب كميات peptide من 1 picomole أو أعلى للحصول على نتائج ملحوظة، مما يجعلها أقل حساسية من mass spectrometry